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2018年5月8日

ヒアリ早期発見のためのLAMP法による
ヒアリDNA検出キットの試験配布

平成30年5月8日(火)
国立研究開発法人国立環境研究所
 生物・生態系環境研究センター
 生態リスク評価・対策研究室
  室長  五箇 公一
  研究員 坂本 佳子
 環境ゲノム科学研究推進室
  室長  中嶋 信美
 

   昨年夏に輸入コンテナおよび港湾施設から特定外来生物ヒアリが相次いで発見されたことから、本種の侵入・定着をいち早く発見し、早期の防除を可能とするために、国立研究開発法人国立環境研究所(以下、「国立環境研究所」という)では、LAMP法を用いたDNA分析技術に基づくヒアリ検出法を新たに開発し、検出キットのプロトタイプを作成しました。今後、国内の地方試験研究機関10機関に本キットを試験配布し、実際に各現場で検出テストを行い、再現性を確認する予定です。
   今回の試験配布により再現性や作業性を確認し、必要に応じて問題点を改善した上で、本キットを完成させ、ヒアリ侵入の早期発見ツールとして、さらに広く自治体や研究機関に実装していきます。
※ヒアリ早期発見のためのLAMP法によるヒアリDNA検出キットの動画につきましては、ご希望の方へ提供いたします。


ヒアリ早期発見のためのLAMP法によるヒアリDNA検出キットの動画(国立環境研究所 提供)

概要

   平成29年6月に特定外来生物ヒアリが尼崎市内で輸入コンテナとともに侵入していることが明らかとなって以降、東京・横浜・名古屋・大阪・博多などの国際港湾を中心に、ヒアリの上陸が次々と報告されており、今後、定着・分布拡大した場合、甚大な経済被害が生じるおそれがあります。

   ヒアリの分布拡大を防ぐためには、いち早くヒアリの存在を検出して防除する必要があります。特に、ヒアリが巣を作っている場合には、巣の大きさが大きくなる前に、的確な薬剤防除を施すことが重要です。しかし、ヒアリは体長が2.5ミリ〜6ミリ程度しかない小さなアリで、目視だけで日本のアリと区別することは難しく、現状ではアルコール標本などを専門家に送付して、形態の顕微鏡観察に基づき同定する以外に、ヒアリの存在を確認する方法がありませんでした。この方法では、ヒアリの送付から同定までに数日を要するため、今後より広範に監視(モニタリング)を行う上で、より早期に、かつ簡易にヒアリを確認する手法が必要とされます。

   そこで、国立環境研究所では、より迅速にヒアリを発見するために、LAMP法(Loop-mediated isothermal AMPlification)というDNA技術を活用したヒアリ検出技術を新たに開発しました。LAMP法とは、特定の種のDNA断片を特異的に増幅して検出する技術で、鳥インフルエンザの検出などにも活用されている技術です。我々研究チームは以下の工程で、ヒアリDNA検出手法を開発しました。


① DNAデータベース上に登録されているヒアリのミトコンドリアDNAの部分塩基配列情報に基づき、ヒアリに特異的に反応する検出用プライマー(DNA複製時の起点となる短いDNA断片)の設計を行いました。
② このプライマーとDNA合成試薬を用いて、ヒアリ1個体の全身および後脚1本のみをそれぞれすり潰して得られたDNA溶液を基にDNA合成反応を行った結果、どちらもミトコンドリアDNA断片の増幅に成功し、DNAの合成量に比例して生じる副産物のピロリン酸マグネシウムによって反応溶液が白濁化することが確認されました。
③ 次に、野外モニタリング時のトラップによって多数のアリ類とともに混獲されたサンプルから同定する場合を想定して、ヒアリ1個体と在来アリ(9個体)を混合したサンプルから、一度にまとめてDNAを抽出し、この抽出液とヒアリ検出用プライマーを利用した同定を試みました。その結果、ヒアリの混じったサンプルでは反応溶液の白濁化が確認され、一方ヒアリが混入していないサンプルでは反応溶液の白濁は認められませんでした(図1)。このことから、野外で採集したサンプルの中にヒアリが1匹でも混入していれば、検出が可能であることが判明し、本手法の高い汎用性が示唆されました(図2)。
④ 以上のDNA検出には、捕獲したアリをすり潰してDNAを抽出する時間(約40分)、および得られたDNAサンプルとプライマーおよびDNA合成試薬をマイクロチューブ内のバッファー溶液に添加し、60℃一定で反応させる時間(約90分)とあわせて約130分の時間があれば確認できることが示されました。

   以上のことから、このLAMP法に基づくヒアリDNA検出技術を使用すれば、野外において捕獲されたアリが、ヒアリであるか否かを、数時間のうちに確認することが可能となると考えられます。

   国立環境研究所ではLAMP法に必要な器材や試薬をセットにした「ヒアリDNA検出キット」を作成し、5月より全国10地点の試験研究機関に配布して、実働試験を行い、再現性の確認を行う予定です。本試験に基づき、問題点があれば改善を施した上で、キットを完成させ、順次、希望する自治体および研究機関に実装してまいります。

LAMP法を用いたヒアリDNA検出試験結果の図
図1.LAMP法を用いたヒアリDNA検出試験結果
左から1.蒸留水、2.在来アリのDNA抽出液、3、ヒアリのDNA抽出液、4.ヒアリ1個体と在来アリ9個体のDNA抽出液、をそれぞれ混入した際の試験結果。
ヒアリのDNAが含まれる3,4のみが白濁することがわかる。
LAMP法によるヒアリ簡易検出法の概略図
図2.LAMP法によるヒアリ簡易検出法の概略図