世界に先がけ、アオコ有毒物質の分析法を開発

　アオコとは、藍藻（シアノバクテリア）と呼ばれる植物プランクトンが富栄養化した湖沼などで異常に増殖し、水面に集積したもので「水の華」とも呼ばれます。アオコを形成する主な藍藻として、ミクロキスティス属、アナベナ属、プランクトスリックス属、アファニゾメノン属、シリンドロスパーモプシス属等が知られています。
　アオコは見た目が悪いだけでなく、腐ったときに悪臭を放つとともに、魚類の大量死を引き起こしたりします。また、アオコを形成する藍藻の中には有毒な種類も知られていて、いろいろな化学構造の有毒物質を作っています。主な有毒物質はミクロシスチン、シリンドロスパーモプシン、アナトキシン-a、サキシトキシンなどですが、これらの毒性は青酸カリよりもずっと強く、1/10から1/200程度の量で致死毒性を示すことが知られています。1種類の藍藻が多種類の有毒物質をつくったり、1種類の有毒物質を様々な藍藻類が作っていることが知られています。

　ミクロシスチンは7つのアミノ酸からなる環状ペプチドで、一般構造式はCyclo-[D-Ala-L-X-D-MeAsp-L-Z-Adda-D-Glu-MDha]で表されます。2番目と4番目のL型のアミノ酸を1文字表記で表し、2番目がロイシン（L）、4番目がアルギニン（R）のものは、ミクロシスチン-LRと呼ばれます。また、この一般構造式とは異なるアミノ酸残基を持つものは、その残基とアミノ酸の位置がわかるように、例えば3番目のD-eAspがD-Aspになったミクロシスチン−LRは、[D-Asp³]ミクロシスチン-LRのように表します。ミクロシスチンには、2番目と4番目のL-型アミノ酸の組み合わせが異なる同族体や3、5、7番目のアミノ酸残基のメチル基が少ない同族体など、100種類以上の同族体が報告されています。

　ミクロシスチンを構成する7番目のアミノ酸残基がデヒドロアラニン（Dha）からデヒドロブチリン（Dhb）に変わったミクロシスチンの総称。1995年にDhb-ミクロシスチン-RRの構造を世界に先駆け報告し、Dhb-ミクロシスチンと命名しました。Dhb-ミクロシスチンのDhb残基には幾何異性体（EとZ）が存在していて、核磁気共鳴スペクトル（NMR）以外では識別が困難です。上段の図[Dha⁷]microcystin-LR）では赤い矢印部分に鋭いシグナルが2本見られますが、中段の図（[D-Asp³,(E)-Dhb⁷]microcystin-LR）では一組の4重線が5.7ppm付近に見られます。下段の図（[D-Asp³,(Z)-Dhb⁷] microcystin-LR）では一組の4重線が6.4ppm付近に見られます。このようにNMRスペクトルではDhb-ミクロシスチンは6ppm付近に特徴的な4重線のシグナルが現れるので、容易に区別することができますが、質量分析では同じ質量数の同族体、特に[D-Asp³]ミクロシスチン類との区別が困難です。

　ミクロシスチン同族体の初代培養肝細胞に対する細胞毒性の強さをミクロシスチン-LR(10)を1として評価しました。表の上の相対LC₅₀（半数致死濃度）の値が小さい同族体ほど細胞毒性が強いことを表しています。ミクロシスチン同族体の構造により毒性の強さにかなり差があることがわかりました。我々が発見したDhb-ミクロシスチン類(1、2、3、4)は、肝臓の細胞に対する細胞毒性がミクロシスチン−LR(10)より強いという結果になっています。また、Dhb-ミクロシスチンでは7位のDhb残基がZ型の配置を取っている方(1、2)が細胞毒性は強いことがわかりました。
　一方、2番目と4番目のアミノ酸がアルギニンのミクロシスチン-RR(16)とその類縁体(12、13、14、15)は比較的細胞毒性が弱いことがわかりました。
　LC₅₀：半数致死濃度

　主なミクロシスチン分析手法についてWHOの暫定基準値である1μg/L程度のミクロシスチンを測定する場合を想定して比較してみました。
　個別分析法では、LC-MS/MS法が感度・精度・選択性・迅速性全てで優れていますが、分析機器が高額です。NMRは感度が低いので、低濃度の分析は現実的ではありません。
　総量分析法では、ELISA法は感度は高いのですが精度が高くなく、キットも高額です。グルタチオン付加-発色法は精度は良くないですがコストが安く、高額な機器を必要としないことから、開発途上国でも使いやすい分析法と思われます。
（測定値のばらつきが小さいと精度が高い、微量で測定できると感度が高い、同族体を区別できると選択性が高いと表示しています。）

　ミクロシスチンの構造にはAddaと呼ばれる炭素20個のβ-アミノ酸、3-アミノ-9-メトキシ-10-フェニル-2,6,8-トリメチル-4,6-デカジエン酸が共通構造として存在しています。このAddaの二重結合部分を過マンガン酸カリウム（KMnO₄）と過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO₄）で酸化して分解すると、ミクロシスチン1分子からMMPB（3-メトキシ-2-メチル-4-フェニル酪酸）が1分子生成します。生成したMMPBを測定することにより、ミクロシスチンの総量を測定する方法がMMPB法です。開発当初は生成したMMPBを蛍光ラベル後、HPLC−蛍光検出器で測定していました。その後、MMPBをメチルエステルとした後、GC/MSで測定する方法も開発しました。今では生成したMMPBを固相抽出し、誘導体化することなしにLC-MS（/MS）で測定しています。筋肉などの生体試料や湖沼の底質に含まれるミクロシスチンの測定法として広く世界中で使われています。

　環境標準物質とは、そこに含まれている化学物質の濃度が正確に求められている環境試料で、環境分析における標準として極めて重要なもので、わが国では当研究所の前身である環境庁国立公害研究所が1980年から開発を進めてきました。現在14種類の環境標準物質を頒布しています。
　環境試料は化学組成が極めて複雑なため、試料の前処理や測定が難しく、単純な標準溶液を用いたのではなかなか正しい分析値を求めることができません。このような場合には、分析試料と化学組成がよく似た標準物質を用いることにより、分析値の正確さを向上させることができます。
　アオコの有毒物質ミクロシスチンの分析精度管理用の環境標準物質を作製するために、有毒な藍藻株を大量に培養し、凍結乾燥しました。乾燥藻体を混ぜ合わせ、63μmのふるいを通しました。この細かい粉体をビンに小分けした後、均質性試験、認証値付与、安定性試験を行い、環境標準物質（NIES CRM NO.26アオコ）が完成しました。NIES CRM NO.26は、ミクロシスチンの分析用に開発された環境標準物質です。

　ミクロシスチンをグルタチオンで処理すると、7位のMdha（Dha でも可）残基にグルタチオンの硫黄原子が付加した化合物が得られます。この付加体を薄層クロマトグラフィー（TLC）で展開した後、アミノ酸の発色試薬であるニンヒドリンで発色させて、ミクロシスチンがあるかどうかとおおよその量を分析することができます。TLC で展開しないで、試験管内で発色反応を行うと、比色法でミクロシスチンの測定ができます。この方法では、[MSer⁷] ミクロシスチンのように7位のアミノ酸残基に二重結合がないミクロシスチン同族体やDhb−ミクロシスチン類はグルタチオンと付加体を作らないため、測定することができません。しかし、このグルタチオン付加法は、測定に高価な機器を必要としないので、開発途上国などでミクロシスチンを測定するための良い方法だと思います。