前鰓類のインポセックス誘導機構の解明:レチノイド X 受容体(RXR)を介した有機スズ化合物の作用機序の解析（平成 17年度）
Elucidation of induction mechanism of imposex in prosobranch gastropods: Analysis of a mode of action of organotin compounds mediated by the retinoid X receptor (RXR)

研究概要

本研究では、現在までに蓄積されてきた知見をさらに発展させて前鰓類におけるインポセックスの誘導機構をより詳細に解析することを目的とする。すなわち、以下の諸点を検討し、明らかにする。1) 前鰓類における生殖輸管の形成及び発達過程に関する組織学的検討2) RXRとインポセックス発症との関係：用量-反応性の検討、形成されたペニス及び輸精管の雄の組織構造との比較、抗RXR抗体を用いた免疫染色によるRXRタンパクの組織内分布3) RXR遺伝子発現部位の特定：組織・部位別発現量の比較、発現細胞の特定4) RXR遺伝子の有機スズに対する応答性の検討：有機スズ曝露に伴うRXR遺伝子発現の経時変化5) 有機スズ化合物に応答する遺伝子の検索6) RXRと結合する遺伝子配列のクローニングによるRXRの標的遺伝子の検索

研究の性格

• 主たるもの：基礎科学研究
• 従たるもの：応用科学研究

全体計画

われわれがこれまでにイボニシを用いて行ってきた実験的検討の結果、インポセックスの発症及び症状の増進においてレチノイドX受容体（RXR）がきわめて重要な役割を演じていることが明らかとなった（Nishikawa et al., Environ. Sci. & Technol., in press, 2004.）。本研究では、現在までに蓄積されてきた知見をさらに発展させて前鰓類におけるインポセックスの誘導機構をより詳細に解析することを目的とする。すなわち、RXRとインポセックス発症との関係を用量-反応性、形成されたペニス及び輸精管の雄の組織構造との比較の観点で精査し、抗RXR抗体を用いた免疫染色によるRXRタンパクの組織内分布を明らかにする。並行して、前鰓類における生殖輸管の形成及び発達過程に関する組織学的な基礎的知見の獲得を目指す。またRXRがリガンド結合性の転写制御因子であることに着目して、RXR遺伝子の発現組織・細胞の特定、RXR遺伝子の有機スズ化合物（TBT及びTPT）に対する応答性、有機スズ化合物に応答する遺伝子の検索、及びRXRの標的遺伝子の検索を行う。

今年度の研究概要

1) 前鰓類における生殖輸管の形成及び発達過程に関する組織学的検討
前鰓類の代表種として新腹足目アクキガイ科のイボニシを用いて、生殖輸管（ペニス及び輸精管）の形成及び発達の過程を病理組織学的手法により明らかにする。また、野外採集個体の観察で不十分な点を補うため、流水式連続曝露試験装置によって正常な雌イボニシに有機スズを曝露させ、人為的にインポセックスを引き起こして、ごく初期からの症状を追跡して組織学的に観察する。2) レチノイドX受容体（RXR）とインポセックス発症との関係
有機スズによる汚染レベルが軽微な海域で採集されたイボニシ雌を用いて、RXRの本来のリガンドである9-cis レチノイン酸（RA）がイボニシのインポセックスを発症させて増進させる効果の再現性とともに用量-反応関係を検討する。また、形成されたペニス及び輸精管が、雄におけるそれらと組織学的に相同であるかどうかを明らかにする。併せて、本実験に供試した個体とともにフィールドで採集された個体を用いて、イボニシRXRホモログに対するポリクローナル抗体による免疫組織化学染色を行い、RXRタンパクの分布を明らかにする。3) レチノイドX受容体（RXR）遺伝子発現部位の特定
有機スズによる汚染レベルが軽微な海域と有機スズ汚染が重篤であった海域でそれぞれ採集されたイボニシを用いて、いくつかの組織・部位（卵巣または精巣、消化腺、鰓、ペニスまたはペニス形成部位、及び頭部の神経節）を摘出してreal time RT-PCR法によりRXR mRNA量を測定する。発現細胞の特定と発現量は、in situ hybridization法で明らかにする。4) RXR遺伝子の有機スズに対する応答性の検討：有機スズ曝露に伴うRXR遺伝子発現の経時変化
有機スズによる汚染レベルが軽微な海域で採集されたイボニシを用いて有機スズの流水式連続曝露試験を行い、経時的に供試個体を取り上げ、それらのイボニシの対象組織（卵巣または精巣、消化腺、鰓、ペニスまたはペニス形成部位、及び頭部の神経節）を摘出してreal time RT-PCR法によりRXR mRNA量を測定する。
これにより、有機スズ曝露に伴うRXR遺伝子発現の経時的な変化を明らかにする。

備考

共同研究者：太田康彦（鳥取大学農学部）