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脳におけるレトロトランスポゾン発現の性差と生殖機能(平成 24年度)
The sex difference of retrotransposon expression in the brain and the relation to reproductive function.

予算区分
CD 文科-科研費
研究課題コード
1214CD006
開始/終了年度
2012~2014年
キーワード(日本語)
レトロトランスポゾン,性差,脳
キーワード(英語)
retrotransposon, sex difference, brain

研究概要

 染色体上で“コピー・アンド・ペースト”を繰り返す“動く遺伝子”レトロトランスポゾンlong interspersed elemenent-1(LINE-1, L1)は神経系に強く発現しており、体細胞においてもゲノム再編を誘導する。予備的検討から、性的二型性を呈する雄型性行動中枢・視索前野においてL1遺伝子発現に雌雄差があることが見いだせつつある。本研究では、【サブテーマ1】どのような機構でL1 の雌雄差が現れるのか、そして、【サブテーマ2】その雌雄差が解剖学・行動学・内分泌学的な雌雄差にどこまで直結するのか、明らかにすることで、L1 による体細胞でのゲノム再編が脳の性差形成を修飾するという仮説を証明し、生理機能の性差形成に影響を及ぼす新たな機構の発見を目指す。

研究の性格

  • 主たるもの:基礎科学研究
  • 従たるもの:応用科学研究

全体計画

L1発現の性差がゲノム再編を介して脳と脳が制御する生理機能の性差形成に関与するか、マウスを用いた動物実験から明らかにする。【サブテーマ1】 ではL1発現・DNA再挿入の雌雄差が形成される機構を分子生物学的手法により解明する。特にレトロトランスポゾンを専門とする連携研究者・石坂幸人博士の協力を仰ぎ、L1のDNA再挿入が起きた細胞を蛍光レポーターで検出できるL1-EGFPトランスジェニック(TG)マウスを用いた解析に力をいれる。【サブテーマ2】では逆転写酵素阻害剤投与やRNAiによりL1機能を抑制した結果起こる生殖機能の異常を解剖学・行動学・内分泌学的手法により解明する。特に、性行動解析を専門とする連携研究者・山内兄人博士の協力を仰ぎ、多面的な行動指標を用いて性行動における異常を見逃さず検出する。

今年度の研究概要

【サブテーマ1】L1発現・DNA再挿入の雌雄差形成機構?
1-1. 発達段階でのL1発現の性差: 7週令マウスの視索前野でL1 mRNAに雌雄差が存在するとの予備的知見を得ている。発達段階での雌雄差を定量PCR解析することで性差要因を推測するヒントとする。雌雄C57/B6マウスを頚椎脱臼で屠殺し脳を摘出、ブレインブロッカーで薄さ2 mmの切片を作成し、氷上で視索前野を外科用手術メスを用いて切り出す。この組織片をビーズ式細胞破砕機とQiagen RLT buffer(Qiagen)を用いてホモジナイズする。RNeasy Mini Kitを用いてTotal RNAを抽出し、100 ng RNAを鋳型にOligo(dT)と逆転写酵素 を用いてcDNAを作成する。L1、rRNAを特異的primerを使い蛍光リアルタイムPCR装置で定量し、L1/rRNA比からL1発現量を算出し、雌雄で比較する。
1-2. L1 DNA再挿入の性差(L1-EGFP TGマウスの解析):
以下に示すL1-EGFP TGマウスを用いてDNA再挿入を解析し、L1生活環の性差の全貌を明らかにする。CMVプロモーターの下流にL1遺伝子を配置し、さらに下流の3’-非翻訳領域に、3’側から5’側に向かって“逆向き”に?CMVプロモーター、?中間部をγ-globin intronで分断された緑色蛍光タンパクEGFP遺伝子、?polyA、の3種の配列が挿入された配列を遺伝子導入されたマウスを連携研究者より供給頂く。このTGマウスでは、L1が発現しない細胞は蛍光を示さないが、?L1 mRNAが作られ、?EGFP遺伝子に挿入されていたγ-globin intronがスプライシングにより取り除かれ、?ゲノムに再挿入された細胞は、緑色蛍光を発するようになる。このマウスでは脳薄切切片における蛍光細胞数検出や視索前野から抽出したDNAを用いたスプライスサイトを標的としたPCRにより、L1 DNA再挿入を定量的に検出できる。このTGマウスを用いて、視索前野L1 DNA再挿入の雌雄差の検討を行う。

外部との連携

連携研究者:
石坂幸人【専門】分子医学/レトロトランスポゾン: 役割? L1-EGFP TGマウスの分与
(連携研究者)役割? L1発現・DNA再挿入解析手法に関するアドバイス
山内兄人【専門】神経内分泌/性行動: 役割?性行動観察、解剖学的解析に必要な試料・装置貸与
(連携研究者)役割? マウス雌雄の性行動観察、性的二型核の解剖学的解析に対するアドバイス

関連する研究課題
  • 0 : 環境健康研究分野における研究課題

課題代表者

前川 文彦

  • 環境リスク・健康研究センター
    生体影響評価研究室
  • 主任研究員
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