トピックス解説
VOCsの発達期曝露による脳での炎症関連反応の修飾

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藤巻　秀和

　室内環境中の化学物質、とくに揮発性有機化合物（VOCs）と体調不良の因果関係が注目を集めており、その解明が求められています。
　現在の一般家庭における室内空気中の化学物質の濃度は、室内濃度指針値を超過する水準にはありません。しかしながら、そのように指針値より低い値であっても、何らかの要因で感受性が高いと、低濃度でも化学物質の影響を受けやすくなっている可能性が考えられています。
　その要因としては、年齢、性別、遺伝的背景、何らかの病気に罹っていることなど生体内の要因と、育ってきた環境など生体外の要因が考えられますが、今回は、低年齢の要因に絞った研究の成果について報告します。

図1：曝露チャンバーと曝露スケジュール

　成人に比べ、子供、特に妊娠期を含め胎児期、新生児期、乳児期は感受性が高いといわれています。実際に、発達期の生体防御機能に鉛、水銀などの重金属類、TCDDやDES（■注1）などの化学物質および医薬品が影響を及ぼすことが報告されています。しかしながら、VOCsの経気道曝露による発達期の生体防御機能に及ぼす影響についてはほとんど報告がみられません。生体内での恒常性に関わる、免疫、脳・神経、内分泌の系はそれぞれ調和をたもちながら発達していると考えられますが、発達期における化学物質の曝露は、この調和にも影響を与えかねません。

　これまで、私たちは、成体（おとな）のマウスを用いて、記憶・学習に重要な働きをしている脳の海馬への低濃度トルエン曝露の影響を炎症反応に注目して明らかにしてきました。そこで、発達期において、トルエン曝露により海馬での炎症反応が誘導されるか、また成長後に曝露の影響が現れるか否かを調べるために、低濃度のトルエンを、胎仔期（妊娠14日目−18日目）、新生仔期（出生2日目−6日目）、乳仔期（出生8日目−12日目）にそれぞれ5日間曝露した後（図1）、生後21日目に炎症に関連した指標の変化を比較検討しました。 その結果、胎仔期、新生仔期に比べ、乳仔期にトルエン曝露したマウスの海馬で炎症を誘導する因子である腫瘍壊死因子TNF-αやケモカインCCL3（■注2）の遺伝子発現が有意に上昇しました。また、神経細胞の成長・分化にかかわる神経成長因子NGFや脳由来神経栄養因子BDNFの遺伝子発現も同様に上昇しました。海馬内で炎症反応に関与する細胞（炎症性細胞）であるアストロサイトとミクログリア細胞のマーカーGFAP（■注3）とIba1（■注4）の遺伝子発現を調べたところ、乳仔期でのトルエンの曝露により両者の発現上昇が観察されました。乳仔期にトルエン曝露したマウスの海馬内で炎症性細胞が活性化し、炎症を誘導する因子（TNF-αやCCL3）をより多く産生したと考えられます。

図2：トルエン曝露によるNF-B遺伝子の発現

　では、何がこのような炎症の引き金になったのでしょうか。従来、VOCsの曝露により活性酸素の合成系が活発になることが報告されていましたので、抗酸化ストレスタンパク質であるヘムオキシゲナーゼー1の遺伝子発現を測定したところ、海馬においてこの遺伝子の発現が有意に増加していました。トルエン曝露が発達期のマウス脳内での酸化ストレスを誘導したことが炎症の引き金になったと推察できます。
　炎症性サイトカインがヒトミクログリア細胞から神経成長因子NGFを誘導するときに、　 核内転写因子（■注5）の一つであるNF-Bを介することが報告されていますので、NF-B遺伝子の発現を調べました。その結果、マウスでは乳仔期曝露でもっともNF-B遺伝子の発現の増加が認められ（図2）、乳仔期曝露による神経成長因子NGFの発現増加には、ヒトと同様のNF-Bを介したメカニズムが働いていることが推測されます。

図3：モリス水迷路探索
上図は、実験全体を模式的に表した図で、出発地点から4つの目印をもとに到達点（プラットホーム）に到達するまでの移動時間や移動軌跡を観察します。中央は、マウスが到達点にのぼった状態の写真です。下図の青線は、マウスの出発地点から到達点までの移動軌跡を表しており、3箇所の出発地点のそれぞれの場合で移動時間と移動軌跡を観察します。

　脳内での神経機能と防御機能の成熟のバランスにより正常な脳機能の発達が営まれていると考えられますが、私たちの研究により、胎仔期や新生仔期に比べ、乳仔期におけるトルエン曝露が、脳内、特に記憶・学習に重要な働きをしている海馬内での炎症の誘導や制止などに影響を与えていることが認められました。
　このように生後21日目に海馬において炎症に関連する遺伝子レベルでの変化が観察されましたので、さらに 、成長後の行動（脳）に影響がみられるか否かについて検討しました。
　乳仔期に低濃度トルエンを曝露したマウスを7週齢まで飼育し、モリス水迷路（■注6）という記憶にもとづく空間学習を探る方法によって脳への影響を調べました（図3）。その結果、対照群に比べトルエン曝露群のマウスにおいて空間機能学習の障害が認められました。

　以上をまとめますと、今回の研究から、発達段階のうち特に乳仔期の低濃度トルエン曝露で、他の発達期にはみられない海馬への影響が認められたこと、さらに成長後にも行動に影響が見られることから年齢要因がトルエンの影響のうけやすさに大きくかかわることが明らかになりました。VOCsに対する感受性を解明するための新たなバイオマーカーの探索にむけた研究の展開に糸口が見えてきました。

■注1　DES：　Diethylstilbestrol　　ジエチルスチルベストロール。流産の防止のためにつくられた合成女性ホルモンであるが、副作用がみられたために現在は使用禁止になっている。

■注2　CCL3：　CC chemokines ligand 3　　マクロファージ炎症蛋白―1アルファ。マクロファージの炎症部位への遊走をうながす因子の一つである。

■注3　GFAP：　Glial Fibrillary Acidic Protein　　グリア線維性酸性タンパク質。アストログリア細胞に特異的に発現し、神経疾患で増加する蛋白質である。

■注4　Iba1：　ionized calcium binding adaptor molecule 1　　ミクログリア特異的カルシウム結合たんぱく質1。神経の栄養や保護作用を有するミクログリア細胞に特異的に発現している蛋白質である。

■注5　核内転写因子：　細胞の核内で遺伝子の発現量を調節するタンパク質。

■注6　モリス水迷路：　海馬に関係する空間学習機能を測定するための行動解析法。

インタビュー
「VOCsを曝露すると脳内に化学物質は蓄積する？」

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藤巻秀和　主席研究員　に聞く

　今回のインタビューは、引き続き藤巻主席研究員にお願いしたいと思います。藤巻さんよろしくお願い致します。

Ｑ１：まず最初に、今回お話しいただいた研究の動機を教えていただけますか？

Ａ１：環境と疾病との因果関係は、不明な点が多いのですが、1日の生活の中心の場である室内での化学物質曝露とシックハウス症候群の発症との関連が既に報告されています。そこで、比較的室内濃度が高いことが報告されているVOCsとの因果関係を明らかにするため動物実験で科学的知見を得ようと考えたのが動機です。これまで、ホルムアルデヒドとトルエンについて研究を進めてきました。

Ｑ２：少し詳しくお聞きします。マウスの例でよいのですが、VOCsを曝露すると脳内には蓄積するのでしょうか？

Ａ２：大人のマウスを用いてトルエン鼻部曝露を行った実験では、曝露30分後にSPME（＊1）-GC/MSで濃度測定をしたところ脳内の海馬での濃度が有意に上昇していました。例えば、50 ppmトルエンの30分間曝露直後では、0.9ng/SPME（トルエン吸着量/SPMEシリンジ）の測定値を示しましたが、曝露終了1時間後には、ほぼ曝露前の値に戻っていました。乳仔期のマウスへトルエン全身曝露をした結果では、1日、6時間の曝露を5日間行った直後の仔マウス脳内での濃度は、平均250 ng/g重量で、血中濃度は590 ng/mlの値を示しています。脳内でのトルエンの蓄積はみられないのですが、曝露されると早い時間に脳内へも移行することがわかりました。

Ｑ３：マウスの実験では、蓄積はみられないものの脳内への移行がみられるのですね。それでは、今回の研究結果は、ヒトでの健康リスク評価にはどのように応用できるのでしょうか？

Ａ３：今回の結果は動物実験での結果ですので、直接ヒトでの評価に結び付けられませんが、妊娠後期から乳児期までの時間的なステージは、VOC曝露の影響の受けやすさを左右する重要な要因であると推測できます。特に、脳・神経の発達、炎症にかかわる免疫機能の発達の時期がVOCの影響の受けやすさには重要と考えられます。ヒトとマウスでは、それぞれの領域・組織の時間的発達スケジュールは違いますので、これからヒトでの違いを明らかにできるようなマーカーを動物実験から提供することに繋げたいと考えております。

Ｑ４：今後の研究に期待したいですね。では、トルエンの発達期曝露で、海馬以外での影響については何かわかっているのでしょうか？

Ａ４：現在のプロジェクトの中で、脳の性分化への影響について解明を行った実験結果があります。脳の雄型、雌型への分化には、出生前後の期間（周生期）のテストステロン濃度が重要と考えられています。妊娠後期から出生直後のラット周生期におけるトルエン曝露で、雄ラットの血中テストステロン濃度が低下すること、性分化した脳で構造の性差がみられる部位である性的二型核の体積の減少などを明らかにしています。周生期曝露が脳の性分化に何らかの影響をもたらすことを示しており、発達期個体の脆弱性と雌雄差を考慮した有害性評価の重要性を裏づけております。

Ｑ５：最後に、これまでに環境科学の研究を長く続けられてこられたご経験から、より研究を活性化してレベルをあげるためには何が重要と思われますか？

Ａ５：研究が継続できた理由は、大きくは常に環境問題でわからないこと、はっきりしない点を、１つでも多く明らかにしたいという信念のようなものを持ち続けられたことだと思います。さらに、より高いレベルへ研究を押し上げるためには、学会や論文などで一流といわれる研究者と接する機会を増やし自分自身を磨くことではないかと考えます。

　とても詳しくご説明いただき、ありがとうございました。
私たちの生活と健康に直接関わるお話ですので、今後の研究についても注目していきたいです。また是非、今後進められる研究についてもお聞かせいただきたいと思います。藤巻さんどうもありがとうございました！

■＊1　 SPME：Solid Phase Microextraction　　マイクロ固相抽出。トルエン吸着量はSPME用シリンジ1本に吸着した量で表示。