特別研究

〔内　容〕
　全国各地の土壌より，浄化能を有する微生物を探索・分離するとともに浄化能を定量化し，ついで，汚染物質分解酵素および分解酵素遺伝子を単離し，その構造と性質を調べるとともに，分解能を強化した微生物を創生する。さらに，浄化微生物の環境利用に際し，適正管理に資するための浄化微生物の迅速・高感度検出法を開発するとともに，自然環境を模擬したフラスコ土壌系あるいは土壌シミュレータ系を用いて，微生物の持つ浄化機能の定量化試験方法を開発する。以上の研究を実施するため，以下の２つの課題と各４つのサブテーマを設定し研究を遂行する。
（１）土壌・地下水浄化微生物の開発と浄化機構の解明に関する研究
　１）浄化微生物の探索と浄化特性の解明
　２）浄化酵素及び浄化酵素遺伝子の単離と諸性質の解明
　３）浄化機能強化型微生物の作成
　４）浄化微生物の検出法の開発
（２）微生物浄化機能の試験方法の開発に関する研究
　１）フラスコ土壌系による浄化機能試験方法の開発
　２）土壌シミュレータによる浄化機能試験方法の開発
　３）バイオリアクターによる浄化機能試験方法の開発
　４）バイオレメディエーション技術のリスク評価手法の開発

〔成　果〕

（１）浄化微生物の探索と浄化特性の解明
　土壌より分離した高濃度ＴＣＡおよびＴＣＥを同時に分解するエタン酸化細菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＴＡ５株及びＴＡ２７株について，分類学的位置を明らかにするため，１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の解析を行った。ＤＮＡシークエンスを調べた結果，ＴＡ５株は，従来報告されているものとは，一致せず，新種と考えられた。ＴＡ２７株のＴＣＥ分解能について検討を加え，エタン濃度が分解に大きく関与すること，最適温度は２５〜３６℃であるが，１０℃でも分解活性を有すること，最適ｐＨは６付近であることを明らかにした。

（２）浄化酵素及び浄化酵素遺伝子の単離と諸性質の解明
　エタン酸化細菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＴＡ２７の粗酵素液を用いて反応至適条件および安定化条件の検討を行った。酸化酵素の至適ｐＨは７．７であり，タンパク量とプロピレン酸化速度の関係を調べたところ，タンパク量の増大に伴い酸化速度の急激な増大が認められことから，ＴＡ２７株の酸化酵素はマルチコンーネントエンザイムであることが示された。
　酵素の安定ｐＨについて検討を行った結果，ｐＨ７．０及び７．７においては２４時間後に，それぞれ７３％，８％の残存活性が認められたが，ｐＨ８．０では２４時間後に完全に失活した。また，ＤＴＴ，ＰＭＳＦ及びｇｌｙｃｅｒｏｌを添加して酵素の安定化を試みたが，いずれにおいても認められなかった。

（３）浄化機能強化型微生物の作成
　これまでプラスミドＮＲ１由来の水銀化合物分解酵素遺伝子群（ｍｅｒオペロン）を広宿主域ベクターｐＳＵＰ１０４にクローニングして，組換え微生物を作成している。今回は，ｍｅｒオペロンを連結させたタンデム化による水銀化合物分解能の向上を試みた。すなわち，ｍｅｒオペロンを連結したタンデムプラスミドを作成し，これらのプラスミドをＥ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＰｐＹ１０１に導入した。タンデムプラスミドｐＳＵＰｍｅｒ２を導入した菌株では，２倍量のｍｅｒオペロンを保持することが確認された。いずれの宿主においてもｍｅｒオペロンをタンデムにしたｐＳＵＰｍｅｒ２を保持する株の方が高い水銀耐性能を示した。ｐＳＵＰｍｅｒ，ｐＳＵＰｍｅｒ２を保持する菌株の生育最小阻止濃度を比較すると，Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１では４０μＭ及び６０μＭ，Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＰｐＹ１０１では４０μＭ及び１４０μＭであった。タンデム化によってＨＢ１０１においては１．５倍，ＰｐＹ１０１においては３．５倍水銀耐性が高まり，タンデム化が水銀化合物分解機能の向上に有効であると考えられた。

（４）浄化微生物の検出法の開発
　ＤＮＡ塩基配列を用いてトリクロロエチレン分解菌Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．Ｍを特異的に検出するために，Ｍ株の分解酵素遺伝子である可溶性メタンモノオキシゲナーゼ（ｓＭＭＯ）遺伝子，膜結合型メタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）遺伝子，及び１６ＳｒＤＮＡをクローニングし，塩基配列を解読して分類学的に近縁の細菌と比較した。この結果，Ｍ株のｓＭＭＯ遺伝子群を構成する６個の遺伝子のうち，ｏｒｆＹとｍｍｏＣは他のｓＭＭＯ遺伝子との相同性は比較的低く，Ｍ株に特異的なオリゴマー作成に適した領域であることが示された。
　Ｍ株の遺伝子のみが増幅できるような各種プライマーを設計した。より簡便に検出するために，微生物細胞を試料とした直接ＰＣＲ法による標的ＤＮＡの増幅を試みた。Ｍ株及び他のメタン資化性菌に対して直接ＰＣＲを行い，プライマーの特異性を検討した。ＰＣＲ条件の最適化を行った結果，反応液当たり１０００細胞まで検出可能となった。

（５）フラスコ土壌系による浄化機能試験方法の開発
　水銀化合物汚染の浄化を目的として，塩化第二水銀分解能を導入した組換え微生物Ｐ． ｐｕｔｉｄａ ＰｐＹ１０１／ｐＳＲ１３４
のバイアルビンにおける水銀除去試験を行った。塩化第二水銀を添加した栄養培地１０ｍｌを１５５ｍｌ容バイアルビンに分注し，洗浄菌体を接種した。振盪培養を行い，培養液中に残存した塩化第二水銀量を定量し，水銀除去能を評価した。培養液中の水銀は培養初期において減少し，そのほとんどが誘導期において除去された。また，塩化第二水銀初濃度を高くするにつれ誘導期が長くなることが認められた。菌体の生育は，１００ｐｐｍまで可能であり，このときほぼすべての水銀が除去された。
　ＴＣＥで汚染した土壌・地下水を用いたメタン資化性菌Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．Ｍによるバイオオーグメンテーションを目的としてステンレス製カラムを用いたバイオトリータビリティ試験の開発を行った。汚染した土壌・地下水の浄化技術の評価に有用なカラム試験方法を確立することができた。
　土壌に添加した浄化微生物の生残，増殖に及ぼす各種土壌要因，環境要因の影響を調べた。土壌中における浄化微生物の挙動を明らかにすることを目的として研究を進めている。
　土壌に接種したＰ． ｐｕｔｕｄａの増殖しやすい条件として，易分解性の有機体窒素の多い有機物を多く含み，ｐＨが高く，水分含量が高いことが考えられた。
　土着生物を死滅させて生物的要因を取り除いた土壌の２種類のサイズの毛管孔隙中におけるＢＨＣ分解菌の増殖・生残過程と土壌孔隙サイズとの関係及びその過程に及ぼす施用肥料の影響について検討した。いずれの土壌においても培養２５週目にも１０１〜１０５細胞／ｇ乾土生残していること，その生残性を土壌孔隙間で比較すると，山口水田土壌の場合は粗毛管孔隙の方が細毛管孔隙よりも生残性が大であるか同程度であるのに対し，鴻巣水田土壌では細毛管孔隙の方が粗毛管孔隙よりも生残性が大であることが認められた。

（６）バイオレメディエーション技術のリスク評価手法の開発
　環境研究技術課と共同で，Ｍ株を用いるＴＣＥ汚染土壌・地下水のバイオレメディエーション実証試験を計画しており，このための基礎データを収集している。
［発　表］Ｂ-９４〜９９，Ｇ-４〜７，ｂ-８１，８２，８３，８５，８７，２０１〜２０４，２０７，ｇ-８，１０，２２