国立機関原子力試験研究費による研究（原子力利用研究）

〔内　容〕
　初年度に当たる平成９年度には，本研究の鍵を握る技術の一つ，ガスイオン源と，ここで発生したイオンを加速器に導入する同時入射系のそれぞれを立ち上げ，性能をチェックするとともに，ビーム引き出し径の絞り込みと途中のスリットの拡大，位置調整等の改良作業を進めた。予備的な検討の結果からイオン源からの引き出しビームをなるべく細く絞り込んで途中の壁・スリット等に触れないようにすることが高精度の達成に重要であることがわかり，ビーム引き出し部分の口径を狭くし，かつ同時入射系の入り口スリット幅を大きく広げる改良を行った。また，加速器の中で最も狭い場所である中央ターミナル内のストリッパーカナルを内径８ｍｍから１１ｍｍのものに変更し，ビームの壁への接触を避けるようにした。さらに各カソードの位置決め方式を改良し，位置決め精度の向上を図った。その結果，同一試料を３つの別々のカソードにつめて繰り返し測定した際のそれぞれの平均値の間の標準偏差が±０．１％を下回る（ただしカウント総数から規定される統計誤差は％程度で，これが最終的に結果の理論的な誤差を決定する），極めて高い繰り返し精度での二酸化炭素試料の測定に成功した。 また，ＨＯｘＩＩ，ＡＮＵｓｕｃｒｏｓｅ，ＢｅｅｒＣＯ２，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ ｄｅａｄ Ｃａｒｂｏｎの４種のスタンダードを用いた実験で，保証値（あるいは従来型の固体イオン源で得られたデータ）とよく一致する結果を得て，繰り返し精度ばかりでなく正確度についても十分な実用性を持つレベルに達したことが確認できた。さらに，２次元目のＧＣと試料捕集装置を導入し，試料捕集条件などに関する基礎的な条件検討を進めた。

〔発　表〕Ｄ-７，９，ｄ-１１

２．環境化学物質に対するバイオエフェクトセンサーの開発

〔目　的〕
　これまで，化学物質の環境汚染による生体影響の評価は，個々の毒性が危惧される物質について，主として動物実験あるいは培養細胞による毒性試験及び環境中における存在量の調査の手順を踏んで行われてきた。しかし，多くの化学物質が環境中に拡散しその複合汚染が進行している状況では，動物実験の信頼性の高さは認めつつも，迅速性の向上や複合暴露に要する時間や労力等の軽減を考慮に入れた新しい毒性評価系の開発が望まれている。これに対処するには，動物実験と培養細胞の中間に位置する組織同等体を用いた毒性評価系が適当と考えられる。組織同等体とは，生体組織から個別に取り出した各種構成細胞と細胞外基質を組み合わせ，組織と同等の形質を有する細胞培養系に構築したもので，従来の培養細胞の簡便さと迅速性を備えながら，他方生体組織と類似することから局所的な動物実験の特徴も備わっている。本研究では，両者の長所を兼ね備えた組織同等体を，環境化学物質の毒性評価に適した形に構築することを目指す。

〔内　容〕
　肺胞上皮組織同等体としては，ｉｎ ｖｉｖｏと同様に，細胞同志は密着結合で結ばれ，細胞の先端面には微絨毛，基底面の直下には基底膜緻密板が存在し，基底面と緻密板は接着斑もしくはａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔで結ばれている上皮構造をとる必要がある。これまで，肺線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル上に，�U型肺胞上皮細胞（Ｔ２）を播種して培養する（Ｔ２-Ｆｇｅｌ）ことにより，Ｔ２細胞同士は密着結合で結ばれ，基底面には基底膜緻密板が形成され，基底面と緻密板はａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔで結ばれることが明らかになった。また，形態学的には，種々の大気汚染ガスに感受性が高い�T型肺胞上皮細胞（Ｔ１）の形態をとった。この共培養系は，上皮組織として条件を満たしているが，上皮細胞の毒性評価系としては，線維芽細胞に対する毒性を間接的に受ける可能性がある点を改良する必要がある。そこで本年度は，線維芽細胞をコラーゲンマトリックスに含まない条件で，上記の上皮組織を形成する培養条件を検討した。
　肺線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルをメンブレンで隔て，Ｔ２細胞をコラーゲンゲル上で共培養すると基底膜を形成しなかった。コラーゲンゲルは，線維芽細胞によって固く収縮する。そこで，コラーゲンゲルを一度風乾し固くした後，溶液に戻したマトリックス上にＴ２細胞を播種し培養すると，同様に基底膜を形成しなかった。両者の条件を組み合わせ，肺線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルをメンブレンで隔て，コラーゲンゲルを一度風乾し後に再膨潤したマトリックス上でＴ２細胞を培養する（Ｔ２-ｆｉｂ-Ｆｃｍ）と，基底膜緻密板を形成した。また，形態学的にも，Ｔ１細胞のに類似した。このＴ２-ｆｉｂ-Ｆｃｍ培養系は，他の条件も満たしているので，肺胞上皮組織の毒性評価系として十分利用可能である。

〔発　表〕Ｅ-３５，ｅ-４９〜５１

３．大気汚染物質の生体影響機構の解明と耐性植物の作出に関する研究

〔内　容〕
　オゾンと接触させたトマトからＡＣＳとアミノシクロプロパンカルボン酸酸化酵素（ＡＣＯ）のｃＤＮＡを単離した。それらのＤＮＡ塩基配列と推定アミノ酸配列を決定したところ，前者は，トマトの培養細胞でエリシター（病原菌が植物に感染する際に生成する物質で，植物の防御反応を誘導する）により誘導されるもの（ＬＥ-ＡＣＳ６）と，また後者は，トマトの果実から単離されたもの（ＬＥ-ＡＣＯ１）と同一のものであることが示唆された。これらの遺伝子の各種ストレス条件下での発現を調べるため，トマトの実生を大気汚染ガスのオゾンや二酸化硫黄，除草剤のパラコートなどで処理し，ノーザン解析を行った。その結果，ＬＥ-ＡＣＳ６のｍＲＮＡは，オゾンとの接触開始後１時間目に一過的に増加するのに対し，二酸化硫黄，パラコートのいずれの処理によっても全く検出されなかった。一方ＬＥ-ＡＣＯ１のｍＲＮＡは，オゾンとパラコート処理により，１時間目から４時間目にかけて増加し，６時間目には減少した。また二酸化硫黄処理の顕著な影響は認められなかった。いずれのストレス処理によってもエチレン生成は誘導されるが，以上の結果により，その誘導の仕組みが互いに異なることが示唆される。
　一方，単離したＡＣＳのｃＤＮＡを適当に改変した後，ベクターに組み込み，トマト，タバコ，ポプラなどの植物に導入した。こうして得られた組換え植物を育て，その生理学的及び分子生物学的解析を行っている。

〔発　表〕Ｂ-５２，ｂ-１３７

４．西シベリア大低地から発生するメタンの起源同定のための計測技術の開発に関する研究

〔内　容〕
　平成８年８月初旬および平成９年２月に西シベリアのスルグートおよびポロトニコボにおいて，航空機により７５ｍ，２０００ｍ，６０００ｍの高度で大気を１ｍ３サンプリングし，研究所に持ち帰り分析した。高度６０００ｍのサンプルは１．８ｐｐｍのメタンに１３０ｐＭの１４Ｃを含んでおり，これをバックグラウンドと考える。例えば，スルグートで冬季に採取した試料の一つは３．２ｐｐｍのメタン濃度で，１４Ｃは８２ｐＭしか含まれていなかった。これらのデータから，バックグラウンドに対して加わったメタンの８０％は１４Ｃを含まないメタンであると結論づけられる。したがって，冬季にバックグラウンド濃度に対し加わったメタンは，おそらくは天然ガスのパイプラインからの漏れに起因すると考えられる。

５．微生物における有害化学物質分解・除去能の発現機構の解明とその活用に関する研究

〔内　容〕
　（１）１，１，１-トリクロロエタン（ＴＣＡ）を好気的に分解する土壌細菌ＴＡ５株及びＴＡ２７株の分類学的検討を加えるとともに，ＴＣＡの分解条件及び各種の揮発性有機塩素化合物に対する分解能について検討した。構造と分解性の関係について検討を行った結果，メタン骨格を持つ化合物については塩素数が２個のジクロロメタンは両菌株ともに良く分解したが，塩素数２，３，４と上がるにつれ分解率が低くなり，四塩化炭素では全く分解が認められなかった。エタン骨格の化合物は，１，２-ジクロロエタンや１，１，２-トリクロロエタンのように両方の炭素に塩素が含まれる化合物の分解が悪い傾向が示された。エチレン骨格の化合物は，ｃｉｓ-１，２-ジクロロエチレン及びトリクロロエチレンはよく分解することが分かった。ＴＡ２７株は土壌中でも分解能を発揮でき汚染の浄化に有用なものと考えられた。（２）揮発性有機塩素化合物分解菌であるＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．Ｍ株を用いて，分解能の発現に影響を及ぼす因子について検討した。この結果，生育炭素源の種類と培養液中の銅濃度が非常に重要な因子であり，分解能はメタンによって誘導され，銅濃度が低いほど分解能の向上化が認められた。（３）Ｍｙｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．Ｍ株の揮発性有機塩素化合物分解酵素であるメタンモノオキシゲナーゼを単離・精製し，本酵素がヒドロキシラーゼ・レダクターゼ及び調節タンパクからなるマルチコンポーネントエンザイムであること，さらにその諸性質を明らかにした。（４）塩化第２水銀を還元し，金属水銀にする。塩化第２水銀還元酵素遺伝子をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに導入し組換え微生物を作成した。水銀還元能は水銀により誘導されるが，構成的に合成される変異株が認められ，遺伝子解析の結果，塩基が一部欠落していることが判明した。

〔発　表〕Ｂ-１００，Ｇ-４，ｂ-８６

６．水界生態系由来の気候変動気体の循環機構解明に関する基礎的研究

〔内　容〕
　本マイクロコズムは，生産者として緑藻類Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ，捕食者として原生動物繊毛虫類Ｃｙｃｌｉｄｉｕｍ ｇｌａｕｃｏｍａ，分解者として細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａの三種から構成されている。この系内の炭素の流れを解明するためには，各生物に取り込まれた炭素量を経時的に知る必要があるため，この混合培養系であるマイクロコズムを各生物に分画する必要が生じてくる。そこで，各生物のサイズの違いを利用して，マイクロコズム溶液をポアサイズ５．０，２．０，０．２μｍのヌクレポアフィルター（Ｃｏｓｔａｒ社製）を用いてろ過分画し，マイクロコズム溶液および各ろ液中の生物個体数を計数し，各フィルター上に捕そくされる割合（阻止率）を求めたのち，トレーサーとしてＮａＨ１４ＣＯ３放射性同位体（ＲＩ）を添加した。添加後，経時的にろ過分画し，各分画におけるＲＩ量は，液体シンチレーションカウンターにより測定した。各フィルターの阻止率およびフィルター上のＲＩ量から，各生物群に含まれるＲＩ量を算出した。すると，Ｃｈｌ． ｖｕｌｇａｒｉｓは１４Ｃを添加後２時間で急速に取り込み，その後Ｐ． ｐｕｔｉｄａ，Ｃ． ｇｌａｕｃｏｍａへ徐々に移動していくことがわかった。
　三種類の生物の混合培養系であるマイクロコズムにＲＩを添加することにより，添加ＲＩを最初に取り込むＣｈｌ．ｖｕｌｇａｒｉｓの吸収速度を算出することができた。
　Ｃｈｌ． ｖｕｌｇａｒｉｓの代謝物を取り込むＰ． ｐｕｔｉｄａやその捕食者のＣ．ｇｌａｕｃｏｍａの炭素吸収モデル式をたて，さらなる解析を進めることにより，このマイクロコズム生態系内での炭素の移動特性について解析可能であると考えられた。

〔発　表〕ｂ-１０，６６