特別研究

８．微生物を用いた汚染土壌・地下水の浄化機構に関する研究（初年度）

〔研究概要〕
　全国各地の土壌・地下水中からトリクロロエチレン（ＴＣＥ）およびトリクロロエタン（ＴＣＡ）等の揮発性有機塩素化合物並びに重金属等が検出され大きな問題となっており，浄化対策として種々の物理化学的手法が用いられている。しかしながら揚水ばっ気や真空抽出法は，コストが高い点，また根本的な分解除去法でないため，新たな浄化技術として，微生物機能を活用して汚染した環境を修復するバイオレメディエーション技術が注目されているが，技術開発が遅れているのが現状である。本研究は，このような状況をふまえ，バイオレメディエーション技術の浄化効果およびリスク評価手法を開発することを目的とした。
　すなわち，全国各地の土壌より，浄化能を有する微生物を探索・分離するとともに浄化能を定量化し，ついで，汚染物質分解酵素および分解酵素遺伝子を単離し，その構造と性質を調べるとともに，分解能を強化した微生物を創生する。さらに，浄化微生物の環境利用に際し，適正管理に資するための浄化微生物の迅速・高感度検出法を開発するとともに，自然環境を模擬したフラスコ土壌系あるいは土壌シミュレータ系を用いて，微生物の持つ浄化機能の定量化試験方法を開発する。以上の研究を実施するため，以下の２つの課題と各４つのサブテーマを設定し研究を遂行した。
（１）土壌・地下水浄化微生物の開発と浄化機構の解明に関する研究
　１）浄化微生物の探索と浄化特性の解明
　２）浄化酵素及び浄化酵素遺伝子の単離と諸性質の解明
　３）浄化機能強化型微生物の作成
　４）浄化微生物の検出法の開発
（２）微生物浄化機能の試験方法の開発に関する研究
　１）フラスコ土壌系による浄化機能試験方法の開発
　２）土壌シミュレータによる浄化機能試験方法の開発
　３）バイオリアクターによる浄化機能試験方法の開発
　４）バイオレメディエーション技術のリスク評価手法の開発

〔研究成果〕
（１）浄化微生物の探索と浄化特性の解明
　ＴＣＡおよびＴＣＥを同時に分解するエタン酸化細菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＴＡ２７株の分解特性について検討を加えた。ＴＡ２７株は，高濃度のＴＣＥ（５０ｍｇ／ｌ）およびＴＣＡ（１５０ｍｇ／ｌ）を分解できること，また種々の有機物を分解できることが判明した。休止菌体は，ｐＨ６．０から８．０で良好な分解を示したが，ｐＨ４．０及びｐＨ９．０においては分解能が著しく阻害された。休止菌体の分解能は培養条件により大きな影響をうけ，ｐＨ３．５のとき高い分解活性を示した。またエタンを１０％以上添加した場合に，高い活性の休止菌体が得られ，汚染土壌の浄化に有効であることが判明した。

（２）浄化酵素及び浄化遺伝子の単離と諸性質の解明
　ＴＣＥを分解するメタン酸化細菌Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ Ｍ（Ｍ株）より，分解酵素遺伝子である可溶性メタンモノオキシゲナーゼ（ｓＭＭＯ）遺伝子をクローニングし，全塩基配列を解読した。この結果，以下のことが明らかとなった。
　ｓＭＭＯ遺伝子は，全長６ｋｂで，ｍｍｏＸ，ｍｍｏＹ， ｍｍｏＢ，ｍｍｏＺ，ｍｍｏＣおよび機能不明なｏｒｆＹの遺伝子群で構成されていた（図１）。これまで報告されている２株のメタン酸化細菌のｓＭＭＯ遺伝子と比較した結果，アミノ酸レベルでも非常に高い相同性が認められた。また，ｓＭＭＯの活性中心に特徴的な構造等，活性に関与する種々の重要な知見が得られた。クローニングされたｓＭＭＯをＥ． ｃｏｌｉに形質転換し，ＴＣＥ分解活性を測定したが，分解は認められなかった。これは，分解酵素のコンポーネントの１つであるヒドロキシラーゼが高分子集合体であるため，適正な立体構造を保持できなかったか，または活性中心に鉄イオンが配置されなかったためと考えられた。

（３）環境中からの微生物ＤＮＡの回収法の開発
　環境中において有用微生物を利用する場合，微生物および遺伝子の挙動を明らかにすることが安全性を評価する上で非常に重要であるため，環境中からの微生物ＤＮＡの回収法の検討を行った。火山灰土に水銀耐性遺伝子（図２）を導入した組換えプラスミドｐＳＲ１３４を保持するＰ．ｐｕｔｉｄａ ＰｐＹ１０１を接種し，３種類の方法でＤＮＡの回収を行った。その結果，土壌試料を撹拌して微生物細胞を回収した後，酵素及び界面活性剤で溶菌するＤＮＡ抽出法（間接法）が最も高い回収率を示した。さらにこの方法を用いて６種類の土壌（砂質土，沖積土及び火山灰土各２種）からのＤＮＡ抽出を行った。回収したＤＮＡ試料は塩化セシウム密度勾配遠心で精製した後，紫外部吸収，アガロースゲル電気泳動により，その純度および濃度を測定し，回収量を求めた。土壌の粘土率，全炭素量等の物理化学的諸性質がＤＮＡの回収率に大きく影響を及ぼすことが判明した（図３）。

（４）ＰＣＲ法による標的微生物の検出
　微量のＤＮＡを増幅して検出する技術（ポリメラーゼチェインリアクション法：ＰＣＲ法）を応用して，培養を必要としない迅速な微生物のモニタリング手法の開発を試みた。菌体内の標的ＤＮＡを直接ＰＣＲ法で増幅し，検出・定量する手法の検討を行った。Ｐ． ｐｕｔｉｄａ ＰｐＹ１０１／ｐＳＲ１３４の水銀耐性遺伝子（ｍｅｒオペロン）の一部を標的ＤＮＡ塩基配列とした。菌体からのＤＮＡの抽出を行わず，直接菌体に対してＰＣＲ反応を行った。Ｐ． ｐｕｔｉｄａ菌体内の目的のＤＮＡが直接ＰＣＲによって増幅できることが確認された。次いで，酵素，緩衝液等の条件検討を行った結果，反応チューブ（５０μｌ）当たり１００細胞数で検出が可能であった。さらに同じプライマーを用いて再度ＰＣＲを行ったところ，検出限界は１細胞であった。

（５）フラスコ土壌系による浄化機能試験方法の開発
　バイアルビンを用いて不飽和土壌中におけるＭ株のＴＣＥ分解能について検討を加えた。Ｍ株はバイアルビン中の土壌中および気相中のＴＣＥを同時に分解・除去できること，また土壌中と気相中のＴＣＥ濃度には良好な相関関係が認められ，気相分析から土壌中のＴＣＥ含有量の推定が可能であることが判明した。

（６）土壌中における接種微生物の挙動
　接種微生物の土壌中での生残，増殖に及ぼす要因について検討を加えた。すなわち土壌に接種したＰ．ｐｕｔｉｄａの生残数の変化を６種類の土壌で調べた。その結果，ｐＨの低い火山灰土１，２，砂質土２で菌数は大きく減少した。土壌に消石灰を加えて，土壌ｐＨが約７になるように補正した場合，いずれの土壌でも生残性が良くなった。特に，ｐＨの低い火山灰土などで生残性が大きく高まり，土壌間差も小さくなった（図４）。以上の結果から，土壌に接種したＰ． ｐｕｔｉｄａの生残には土壌ｐＨが最も大きくかかわっていると考えられた。
　土壌に接種するＰ． ｐｕｔｉｄａの生残性を高めるため，資材に吸着させて土壌に添加する方法を試みた。その結果，バーミキュライトやカオリンなどの粘土に菌を吸着させて，土壌に接種すると生残性が高まることが認められた。
　山口県農業試験場の水田圃場の無窒素肥料区・化学肥料区・堆肥多量区から採取した３種類の土壌にＢＨＣ分解菌を細毛管孔隙（平均直径：０．１９〜３μｍ，毛管水の分布部位），粗毛管孔隙（平均直径：３〜４８μｍ，毛管重力水の分布部位）に入るような方法で添加し，経時的に土壌中のＢＨＣ分解菌を計数し，その生残性を調べた。ＢＨＣ分解菌の生残性はいずれの処理区においても，細毛管孔隙の方が粗毛管孔隙よりも高い傾向があり，特に無窒素区でこの傾向が顕著であった。その生残性は，投与肥料の種類によって異なっており，両孔隙ともに無窒素区で最も高く，以下堆肥多量区，化学肥料区の順に低下した。
　以上の事実は，細毛管孔隙の方が粗毛管孔隙よりもＢＨＣ分解菌の生残に好適な土壌部位であること，およびその生残性が投与肥料の種類によって少なからぬ影響を受けることを示している。また，原生動物等の補食者が細毛管孔隙には入ることができない大きさであることから，細毛管孔隙に添加されたＢＨＣ分解菌はその補食を免れていることが推測された。

（７）バイオレメディエーション技術のリスク評価手法の開発
　Ｍ株を用いるＴＣＥ汚染土壌・地下水のバイオレメディエーション実証試験を計画しており，このためのリスク評価項目について検討を加えた。
〔発　表〕Ｂ-１０９〜１１５，Ｇ-９，Ｌ-８，ｂ-７７，７８，１８８〜１９５，ｇ-９，３６，３７