特別研究

６．化学物質の生態影響評価のためのバイオモニタリング手法の開発に関する研究

〔研究概要〕
　近年，生態系の危機を憂慮する国内外の社会情勢に伴い，化学物質の生態影響を配慮した環境基準や規制のあり方が求められている。これまでの研究から，化学物質の潜在的な生態影響が無視できないこと明らかにし，また化学物質の生態影響評価には生物間相互作用を考慮することが重要であることを示した。本研究では，化学物質の潜在的な生態影響をバイオモニタリングにより連続的に評価する手法と，バイオモニタリングに用いた生物の各種反応が化学物質の生態影響をいかに指標するかに関しての研究を行う。これらの調査・研究の成果に基づき，化学物質に対する生物の反応（あるいは影響）レベルをもって，化学物質の総合的毒性から生態系を保全するための環境基準や規制・対策のあり方と，その具体的な方法を検討する。
　以下の二つ課題に従って調査・研究を行う。
１）高感受性水生生物の選定と生物相互作用系に及ぼす化学物質の影響解析
　生物は食物連鎖関係，餌や生活空間などをめぐる競争関係など様々なバランスの下で共存している。化学物質は致死濃度以下のレベルでもこれらの相互関係を撹乱し，生態系に予測し難い間接的影響を及ぼす。水界生態系を構成する様々な水生生物の中から，生態系の中での役割（機能）や化学物質に対する感受性，実験生物化の可否などを検討し，バイオモニタリングに有効な水生生物を選択するとともに，生物間相互関係に基づいた生態影響評価手法を検討する。
２）生態影響評価のためのバイオモニタリング手法の開発
　化学物質に感受性の高い試験生物を用いたバイオモニタリング手法の開発と，試験生物の反応が生態影響を如何に指標するかに関しての調査・研究を行う。バイオモニタリングでは，河川水や底質などを定期的に採取し，これらのサンプルに試験生物を暴露して，化学物質の総合的な影響を評価する手法と，河川水を連続的に水槽や水路に流して，水生生物の各種反応（行動，生長，繁殖，酵素活性など）を常時，または定期的に監視・計測する手法がある。反応を迅速に評価するためには，特に画像解析の手法が有効である。試験に使用する水生生物は，主として飼育化された生物を用いるが，生態影響評価で重要であっても飼育化が困難な場合には，野外から採集した生物についてもバイオモニタリングによる化学物質の評価手法を検討する。

〔研究成果〕
　本年度は，桜川バイオモニタリング施設の整備と新たな試験生物の検討，及び河川水の連続暴露によるバイオモニタリング手法の開発，それを用いて河川水（桜川）の毒性評価を行った。

（１）桜川は霞ヶ浦に流入する最大の河川である。その河口から５ｋｍにバイオモニタリング施設を作り，河川水を引き込んで，生物を連続的に河川水に暴露しその反応をモニタリングする。本年度は，河川水の水温をコントロールし，一定温度で，バイオモニタリングが可能となるように施設の整備を図った。バイオモニタリングに使用する生物として，新たにイチョウウキゴケ，ウキクサ（２種），オオカナダモ，ヨコエビ，ミジンコ（８種）などに関して，バイオモニタリング生物としての適否を検討した。

（２）バイオモニタリング施設内の水路から，週３回の頻度（月・水・金曜日）で河川水を採取し，農薬分析，セレナストルム増殖試験，ヌカエビ試験（死亡率），などにより，河川水の潜在的毒性の変動を評価した。ヌカエビ試験で見ると，河川水の毒性は前年度に比較し著しく低くなっており，７月下旬までは河川水中のヌカエビ死亡率（１４日後）は最高でもに２０％前後が２回起こっただけであった（６月下旬）。一方，連続的に河川水を流した水槽に，５月から各月の初めに１００個体のヌカエビ（生後１カ月）を導入し，その後の死亡率を調べた。連続暴露においても，河川水サンプル中の死亡率が顕著でない場合は，死亡率は低く５月導入の場合でも７月下旬における死亡率は２０％程度に止まっていた。しかし，７月末から８月初めにかけ河川水の毒性は急速に高まり，５〜６月に導入した集団は４〜５日間で１００％ 死亡した。８月初めに導入した集団は２０％程度の生き残り，その後回復の傾向を示し，産仔する個体も認められた。ヌカエビに対する毒性物質は，その時期にフェノブカルブ，フェニトロチオン，マラソンなどの殺虫剤と２種の殺菌剤濃度が高まり（図１），これら化学物質の複合影響によるものであった。これらのバイオモニタリングにより，定期的な水のサンプリングでは，見逃す可能性が高い顕著な毒性を，確実に検出できることを示した。５〜７月下旬にヌカエビ試験による毒性が，低かったのはその間に殺虫剤がほとんど検出されなかったことによる（図１)。

（３）除草剤の汚染に関しては９種類が検出され，河川水サンプル中でのセレナストルム（緑藻）の増殖は５月中旬をピークに対照の２０％ 程度にまで阻害された（図２)。一方，河川水（調温，２２〜２３℃）を連続的に流した小型水槽にウキクサ（２種）を浮かべ，その後の生長を調べることにより，化学物質の毒性をモニタリングする手法を検討した。水槽の水面には仕切を設け，ウキクサを個別に１０個体暴露し，４，７，１４日後に葉面積を測定し生長の変化を調べた。２種のウキクサとも，様々な除草剤が検出された５月から６月にかけ（図１），生長は著しく阻害され（図２），極端な場合は枯死した。一方，河川水サンプル中のセレナストルム増殖試験では，生長の阻害は６月初旬には回復し，ウキクサ連続暴露の方が微量な除草剤の生態影響をより感度よくモニタリングできる可能性が高い。前年度の結果から，セレナストルム増殖阻害の原因物質は，プレチラクロールが主因で，わずかにブタクロール，メフェナセットの相加的影響が示唆されたが，ウキクサの生長阻害もこれらの除草剤の複合影響である可能性が高い。河川生態系の中で，水生植物の役割は，様々な水生生物の生活の場，繁殖の場として重要である。微量な除草剤の水草に対する総合毒性のバイオモニタリングは，水草の感受性の種間差なども含め様々な検討が必要である。
　除草剤の一次生産に及ぼす影響に，紫外線の影響が如何に作用するかに関して生物試験を実施した。セネデスムス（緑藻）を５〜２０μｇ／ｌのシメトリンに暴露した場合，これらを０．０６，０．５９Ｗ／ｍ２の紫外線（ＵＶ-Ｂ）で照射した場合は全濃度で影響はなかったが，１．３３Ｗ／ｍ２で照射した場合は，１０〜２０μｇ／ｌのシメトリンでも，セネデスムスの光合成活性（４-ｈ試験）は，対照の８０〜７０％まで減少した。このような複合影響が長期間に及ぶとき一次生産にいかなる影響を及ぼすかに関してはさらに検討を要する。

（４）ヌカエビの行動変化による化学物質のバイオモニタリング手法を検討した。ヌカエビを低濃度の有機リン系殺虫剤（フェニトロチオン）に暴露すると，逃避行動に似た特異な行動を示す（前年度の成果）。そこで本年度は河川水（桜川）を連続的にかけ流した水槽に入れたヌカエビ（生後１カ月，５個体）の行動を，１）遊泳速度と ２）検出個体数（水槽底面より高さ７ｍｍより上に泳ぎ出し，しかも１分間の移動速度が３ｍｍ以上のもの）および，３）運動量（遊泳速度と検出個体数の積で相対的な運動の程度を表す）の変化として，画像解析によりモニタリングした。顕著な事例として，７月３１日から１週間に及びヌカエビの行動異常が続いたが，その原因は河川の上流域で殺虫剤・殺菌剤の空中散布があり，水中で検出された数種の農薬類（図１）によるものと考えられる。汚染された河川水にさらされるとヌカエビは水槽底を離れて水中に泳ぎ出す頻度が増加したり，遊泳時に急に方向や速度を変えるなど，平常時にはない行動が現れた。また，平均した遊泳速度も上昇したがこれは，汚染の最もひどい期間よりも，農薬汚染がある程度減少した期間の方が高い傾向にあった。ただし，遊泳速度の上昇を含め，このような異常行動は長時間は続かず，先の７月３１日の例では異常行動が見られ始めてから１８時間を過ぎる頃からはかえって動きが緩慢となった。観察に用いたヌカエビが疲弊，または障害を受け，反応が鈍化したものと考えられる。その結果，ヌカエビ行動の画像解析によるバイオモニタリング手法として，河川水に暴露して１日以内のヌカエビの運動量が適していた。１年間のデータから上記に適合するデータを抽出し，運動量（日平均）として図３に示した。これによると，ヌカエビは４月，７月末から８月初旬そして１１月中旬に運動量が大きく，逆に，冬季は概して低い値であった。７月末のピークは前述の農薬空中散布時のものであるが，他２つは水田への農薬散布時期ではなくその原因は現在のところ不明であり，殺虫剤以外に行動異常を惹起した化学物質（５〜６月に検出された除草剤など）の流入も考えられ，今後その原因物質を室内実験等で解析する。

（５）ドブガイによる河川水中の有害化学物質モニタリング手法の検討を行った。ドブガイは中型の二枚貝で河川や湖沼に生息し，底泥から水管を伸ばし主に浮遊藻類，有機懸濁粒子を摂食する。農薬など化学物質はの多くはこれらの懸濁粒子に吸着することが知られているる。ドブガイを用い，水に溶解，または藻類等の懸濁粒子に吸着した化学物質（調査地点では農薬類）の総合的な影響の評価手法の開発を目指した。将来的には現場法（測定場所に試験生物を置き影響を計測する方法）の１つとして二枚貝（他に，シジミを検討）を用いた，バイオモニタリング手法の開発を目的とする。ドブガイを個体識別し，２週間ごとに体重（殻を含む生体重）を１年間にわたり計測した。生長速度（平均値，ｎ＝２６）は１月には０．００２１であったが，５月はじめにかけて指数的に増加し年間でも最高の０．０１６６に達した。しかし，６月から７月中旬までの生長速度は，それまでの半分ほどに低下した。その後，生長速度は９月はじめにかけて回復するが９月半ばから再び減少した。生長速度の増減を環境要因（水温，農薬類の濃度，クロロフィル量（餌としての藻類量）など）と相関させてみると，冬から春にかけての増加は水温の上昇に伴い，９月の落ち込みはこの時期水中クロロフィル量が極端に減少することから餌不足によるものと推定される。しかしながら，６月から７月にかけては，そのいずれでも説明できず，水中の農薬濃度の検出時期と一致し，間接的ではあるが農薬類の影響と考えられる。生長に及ぼすこれらの環境要因をさらに検討する余地はあるが，ドブガイの生長速度の変化から化学物質の総合的な影響をモニタリングできる可能を示した。
　ドブガイを５〜１０月の間，毎月桜川河川水に１カ月間暴露し（バイオモニタリング施設・水路），様々な農薬類暴露に対する薬物代謝の変動に基づいたバイオモニタリング手法の可能性を検討した。テストステロン６β水酸化の活性は８月導入のドブガイをピークに最も顕著な変動を示した。８月初旬に殺虫剤，殺菌剤に暴露されているが，水温との相関も極めて強く，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ （ＣＰＹ）に依存した変動であるかどうかは現在不明である。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓ-Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＧＳＴ）は５月に導入したもので最高値を示したが，５月中に出現した様々な除草剤（図２）の薬物代謝を反映したものかどうかについては，単独の除草剤暴露試験などによりさらに検討を要する。Ｂｅｎｚｏ ［ａ］ ｐｙｒｅｎｅ ３-ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ，Ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅｄｉｏｎｅ（テストステロン代謝），コリンエステラーゼなどには顕著な変動は認められなかった。薬物代謝の変化を用いたバイオモニタリングは，魚類でなされた報告が圧倒的に多いが，魚類は移動範囲が大きいのが難点である。貝類は移動がほとんどないため，今後酵素活性の変化によるバイオモニタリング手法の有効性をさらに検討する。

（６）最近はメダカでさえも少なくなり，絶滅の危機があるとさえいわれている。その原因として一般的には，生息環境の破壊が言われている。水質的に，農薬類の汚染が関与しているかについて，河川水（桜川）を連続的に流した水槽にメダカを導入し，生長・産卵数などの変化を対照と比較して検討した（対照：研究所・水生生物実験棟の地下水）。それほど顕著ではなかったが，バイオモニタリング施設内で河川水（桜川）に連続暴露したメダカの生長，産卵数は対照よりも低い値を示した。さらに卵の発生，ふ化率などに関しても調べることとする。
〔発　表〕Ａ-３５，Ｂ-８３〜８５，１１６，Ｈ-３１，３２，ｂ-８６，８７，１２２〜１２４，１５２〜１５５