内分泌撹乱化学物質総合対策研究

〔目　的〕
　内分泌撹乱物質（環境ホルモン）の微量分析と迅速スクリーニング法によって環境中における環境ホルモンの種類と量が把握できることになる。種類と量の把握から環境ホルモンの将来予測が可能となるはずである。以上の理由から，本研究では　１）環境中の内分泌撹乱物質（環境ホルモン）の微量計測法の開発に関する研究　２）環境ホルモンの新たな生物検出法に関する研究の２分野により内分泌撹乱物質（環境ホルモン）の環境中における汚染実態を明らかにする。

〔内　容〕
　（１）環境ホルモンの微量計測法の開発に関する研究
　超微量で生物の根幹となる生殖機能を狂わせる物質（外因性内分泌撹乱物質）を定性定量にするには，新たな有機化学物質の微量分析の開発が必要である。超微量分析としては活性物質の定性（化学構造），定量，細胞内分布，体内分布を対象とし，誘導体化後GC/MS法の応用をエストラジオール及びフェノール類に対して行った。また，新たな方法としてLC/NMRを用いた環境ホルモンの同定手法，LC/MS/MS法を用いた環境ホルモンの定量分析手法，加速器MS法等について検討した。また選択的な吸着法によるクリーンアップ法について予備的な検討を行った。
　（２）環境ホルモンの新たな生物検出法に関する研究
　陸水系のリアルタイムバイオモニタリング手法，底生生物種（ユスリカ，二枚貝等）を用いた繁殖障害試験法，魚類の性行動変化および生殖機能を指標とした検出手法，巻貝の雄性化を指標とした生物検定法を検討した。また，ヒトエストロゲンリセプターとの競合結合を用いた生化学的検出法，イーストを用いたTwo Hybrid法，MCF-７等のほ乳動物およびヒトの細胞を用いた女性ホルモン作用の検定法，環境ホルモン物質によってほ乳動物細胞で誘導されるタンパク質及び遺伝子を指標として用いることによりホルモン活性の検出する方法等について検討を行った。

〔成　果〕
　内分泌撹乱化学物質の汚染実態の解明の上で，本課題１がまず最初に手をつけなければならないものであった。本年度の内分泌撹乱化学物質の研究において本課題のなかでも迅速な生物検定法について経験と技術の習得を行うことが必要であった。環境庁のモニタリングのための分析法について評価を加え，改善のための知見や，より選択性の高い分析法に関する情報を蓄積した。１７β-エストラジオールの分析は従来ELISA法により行われていたが，市販キットによって測定値が異なること，またかなり高い値が報告された。このためNCIGC/MSを標準的な分析手法として本年度の調査は行われる。この根拠として本課題で行われた水中ビスフェノール分析法の研究がある。
　特異的な検出能を持つクロマトグラフィーの応用面で進展があった。NCIを用いたガスクロマトグラフ質量分析法及び電気化学検出法を用いた高速液体クロマトグラフィーにより，水中の１０pptレベルのアルキルフェノール類が容易に検出でき，ルーチン的に利用できるものとなった。LC/MS/MS法及びLC/NMR法は予備的な検討が開始された。
　エストラジオール・エストリオール・エストロン及びその抱合体の固相カラムを用いる抽出法の検討を行い，アミド基を有する固相カラムを用いることにより，良好な回収が得られた。また，環境ホルモンの選択的濃縮法を開発するために，Molecular Inprinting法を用いてビスフェノールＡの選択的吸着高分子を合成した。
　内分泌撹乱作用をプリスクリーン的に検出し，あるいは環境中の内分泌撹乱物質の検出のための高感度な生物検定法の開発と利用を進めた。内分泌撹乱作用のin vitroの検出法として，イーストを用いたTwo‐Hybrid System，によるリセプターとの競合結合を観察するELISA法及び蛍光偏光解消度測定法，及びヒト乳がん細胞（MCF-７）の増殖を観察する方法等を試験し，ルーチンレベルでの試験系を確立した。特にイーストを用いたTwo‐Hybrid Systemによるエストロゲンアッセイでは簡便化，高感度化のための改良を行い，９６％ウェルマイクロプレートと化学発光性を組み合わせることにより，多試料を迅速かつ高感度に測定できる手法を開発した。
　新たな系としてはヒト神経細胞腫NB-１細胞を用いて予備的検討を行った結果，NB-１細胞における神経突起の伸展に影響を及ぼすことを明らかとした。in vitroのアッセイ系としては，メダカを利用した検出系，ベタの胚化時の奇形出現率の増加を検出する系，ヒメダカを用いたライフサイクル試験法の開発を行った。後者において，仔魚期の試験環境の検討を詳細に行い試験系の安定性を確保するとともに，性成熟や二次性徴，生殖巣の組織学的検討，ビテロゲニン等の卵黄タンパクの誘導合成，生殖行動について調べ，化学物質の作用濃度に関する知見を得た。トリブチルスズ，ベンズＡピレン等を妊娠ラットに経口投与し新生仔のリンパ球の自己反応性T細胞を抑制するサブポピレーションの比率を検討した。比率が低下し自己免疫反応が起きやすい状態になることが推察された。
　内分泌撹乱物質の作用により特異的に誘導されるタンパク質や遺伝子の検索をジーンアレイ法を適用して進めた。内分泌撹乱物質を含むことで知られているディーゼル排気に暴露した６種類のmRMA発現が増加した。ジーンアレン法以外にDiffential Display法等を用いて内分泌撹乱物質による発現する遺伝子の解析が可能であった。
〔発　表〕B-８６，９３，９５〜９７，１１７，D-６，１７，１９，b-２３４，２３５，d-２１〜２５