環境修復技術開発研究

〔目　的〕
　平成９年のナホトカ号油流出事故は，我が国周辺海域における水産資源への被害のみならず，海岸部の貴重な生態系及び景観にも重大な影響をもたらし，このような被害は今後も生じる可能性がある。環境庁では，油漂着海岸における栄養剤散布による土着性分解微生物を用いた浄化技術に関して環境影響及び有効性の両面から調査を行った。海外では数例のバイオレメディエーション実施例があるが，現場状況により浄化効果が左右される。また，生態系に対する安全性の問題が解決されていない。それ故，生態系への影響評価についてモデル生態系による評価解析と現場における実際の生態系に及ぼす影響評価解析を行うことが重要である。適正なバイオレメディエーション技術の確立のためには，有効性，安全性についての問題を解決することが不可欠である。本研究では，油汚染により損傷をうけた海域の環境修復を図るために，有効なバイオレメディエーション技術の開発ならびに生態系影響評価手法の開発を行う。

〔内　容〕
　本年度は研究計画書に記載された課題のうち以下の研究を遂行した。
　（１）バイオレメディエーションを活用した重油分解の高度化技術の開発
　海水中に広く分布し石油分解時に優占化するAlcanivorax属細菌を増殖させ，アルカン分解能を促進させるための至適栄養塩濃度条件を検討した。また，人工干潟装置を用いてバイオスティミュレーション用の緩効（徐放）性合成窒素肥料の特性を評価するとともに，安定同位体分析を応用して重油の微生物分解量を定量する手法の開発を行った。
　（２）底質を含む簡易モデル生態系（マイクロコズム）による重油分解と生態系影響評価手法の開発
　干潟底生動物としてゴカイ，細菌よりなるモデルマイクロコズムを作成し，重油のゴカイの生存および捕食能に対する影響，およびゴカイと共存するバクテリアへの影響についての解析評価を行った。
　（３）汚染現場生態系（メソコズム）における重油の自然分解とバイオレメディエーションによる効果の総合評価
　兵庫県香住町海岸において栄養塩を散布し，土着細菌によるバイオスティミュレーションを行い，重油各成分の変動により分解反応を評価した。また，甲殻類のヨコエビを用いた安全性評価も検討した。さらに，栄養塩添加が土着細菌群集構造に与える影響を評価するため，分子生物学的手法を用いて解析を行った。

〔成　果〕
（１）バイオレメディエーションを活用した重油分解の高度化技術の開発
　１）油分解菌による重油分解促進のための栄養塩添加の効果と栄養塩の濃度，N/P比変化における重油の分解に及ぼす影響評価
　Alcanivorax属アルカン分解菌の増殖，および重油分解活性発現に必要な栄養塩添加濃度等を明らかにした。Hale人工海水を三角フラスコに分注し各種条件で検討した。Alcanivorax ST-T１株の増殖率はいずれの栄養塩濃度下でも同様であったが，アルカンは窒素濃度が１０mg/l以上では７日目で９０％以上，飽和分は栄養塩濃度の高い順に早く減少した。また，リン濃度が高いほど分解速度が高まり，１mg/l以上では７日間で約９５％分解した。以上より，Alcanivorax ST-T１株の最大比増殖速度は１．５７×１０８／日，半飽和定数は１２．２mg/lであり，重油分解を促進させ，かつ海水残存濃度をできるだけ軽減させる窒素，リン濃度は，それぞれ１０mg/l，１mg/lでN/P比は１０であった。
　２）油濁干潟装置を用いたバイオレメディエーションの有効性の検討及び環境への汚濁負荷に関する研究
　緩効性肥料（IBDU，CDU，ホルム尿素）散布の油分解促進効果を，潮汐を再現した室内模擬油濁干潟装置を用いてCO２放出速度と同位体比から検討した。また排出海水の化学分析を行い肥料成分の流出等について検討した。CO２放出量は，IBDU＞ホルム尿素＞CDU＞対照系の順であった。CO２の安定同位体比の収支から油分解量の評価を試みたが，いずれの肥料も油と類似した炭素同位体比であり油由来のCO２評価には至らなかった。また排出海水には高濃度の有機炭素・窒素が含まれており，施肥肥料がそのまま溶出していたことが示された。３種の肥料中，最も溶出が遅く持続性がある肥料はIBDUであった。さらにIBDU系の溶存酸素濃度は他系よりも低く，したがって微生物にとって最適な増殖条件を維持できたと考えられた。

（２）底質を含む簡易モデル生態系（マイクロコズム）による油分解と生態系影響評価手法の開発
　ゴカイ，細菌よりなるマイクロコズムにナホトカ号の船首部分抜き取りＣ重油を各種濃度で添加した結果，ゴカイ単独系では急性毒性より巣穴形成や呼吸阻害等の物理的影響が大きく，半数致死量は７１mg/cm３で，１〜１０mg/cm３では通常摂食量の１/６〜２/３に減少するが，１２日間で通常量に回復した。また，細菌とゴカイの共存系では細菌の増殖も活発となり，重油分解率も高まった。なお，ゴカイが重油による影響を受けず生存し続けた系においては，水質への影響はみられなかった。

（３）兵庫県香住町佐古谷海岸におけるバイオレメディエーション実証試験
　１）重油の分解評価
　本年度は，�@実験装置として透水性アクリル容器　�A重油分解菌活性化のために農業用緩効性肥料　�B供試重油としてナホトカ号由来のもののほかに燃料用重油と海砂の混合したものを使用し，実験装置は潮感帯と沖合に設置した。試験は平成１１年の７〜１０月の約３カ月間行った。すべての試験区において，アルカン等の個別の化合物について良好な分解がみられた。ナホトカ号由来重油については，沖合設置区では肥料添加区と非添加区との間で分解程度の有意な差はみられず，潮感帯では肥料の添加がむしろ分解を阻害する傾向がみられた。燃料用重油については，沖合設置区では肥料を添加しても顕著な効果は認められなかった。潮感帯では当初，肥料添加区の方が非添加区よりも分解が遅れていたが，最終分解率は肥料添加区の方が高かった。以上より供試重油の種類，分解実験場所により，肥料添加効果が異なった。細菌群集構造変化を分子生物学的手法で解析した結果，肥料添加区・非添加区ともにほぼ同様の傾向が観察された。これより，添加した栄養塩量は細菌群集構造を変化させるのに十分な濃度ではなかったことが考えられた。
　２）野外試験区における安全性評価法の検討
　重油分解を行わせたアクリル容器内の海水について，ジクロロメタン抽出物の薄相クロマトグラフィー（TLC）分析と，ヨコエビ類（甲殻類）を用いた急性毒性試験を行った。TLC分析では極性画分のみ検出され，その濃度は各重油分解実験装置内部，周辺域の海水間で有意な差は見られなかった。以上より，重油の溶出，肥料の添加はヨコエビの生残に影響を及ぼさないことが示された。
　３）栄養塩散布の微生物生態系に及ぼす影響評価手法の確立
　自然界に存在する細菌の多くは培養が困難であるため，前年度はPCRを用いたDGGE（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法による解析を行った。しかし，本法では細菌群集構造の種レベルでの解析は困難なため，本年度は１６S rDNAライブラリーを作成し各クローンの塩基配列決定による解析手法を併用し，細菌群集構造変化を解明した。佐古谷海岸試験現場で得られた一般細菌１６S rDNAのほぼ全長をPCRで増幅した後，１６S rDNAクローンライブラリーを構築し，１調査地点につき約５０クローンの部分塩基配列を決定して解析した。PCR-DGGE法とクローンライブラリーに基づく解析結果は良く一致し，栄養剤散布期間中は散布区と対照区の細菌群集構造は著しく異なっていたが，散布終了３カ月後は類似し，回復することが示された。両手法の併用により，微生物群集構造の変化を正確に把握できることが明らかとなり，また，主成分分析等の統計的解析を加えることにより，構造変化がより明確にされることがわかった。
〔発　表〕B-３５，b-２３，７２，１３３，１３４，g-１５，３０，４４