特別研究

６．環境中の「ホルモン様化学物質」の生殖・発生影響に関する研究

〔担当者〕

〔期　間〕
平成９〜１１年度（１９９７〜１９９９年度）

〔目　的〕
脂溶性が高く難分解性の環境汚染化学物質は食物連鎖を通して生体内に蓄積するが，これらの中には，正常な性ホルモンの機能を乱すことにより様々な生殖影響を引き起こすものがあり，環境ホルモン様物質と呼ばれている。実際，鳥類，は虫類，海棲ほ乳類などの野生生物において生殖異常が認められ，これらの異常は野生生物の体内に蓄積された環境ホルモン様物質により引き起こされているとの指摘がある。先進国においても，近年，女性の乳がん，男性の睾丸腫瘍の発生増加及び精子数の減少が報告され，これらの現象と環境ホルモン様化学物質との関連が疑われている。特に周産期における暴露は，器官や機能の形成される時期だけに影響は不可逆的になる可能性が高く，また，感受性も高い。環境中のホルモン様化学物質の子（次世代）への影響，とりわけ生殖能力への影響は人類の存続にかかわる問題であり，これらの影響のリスク評価は，重要かつ緊急に対処すべき課題であると考えられる。本研究では，環境中のホルモン様化学物質の生殖・発生影響のリスク評価のための基礎的データを得ることを目的とする。

〔内　容〕
本年度の研究は，計画書に記載された以下の２課題に沿って実施された。
課題１　定量的リスク評価のための環境中のホルモン様化学物質の生殖・発生影響に関する実験的研究
課題２　環境中のホルモン様化学物質のスクリーニング手法及び暴露量の推定に関する研究
　ホルモン様化学物質として，最近，ゴミ焼却場周辺の汚染，母乳汚染などで問題となっているダイオキシン（ＴＣＤＤ）を昨年に引き続きとりあげた。
　課題１では，１）生殖機能の発生過程に及ぼす影響として，ラットを用いて，２，３，７，８−四塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）の妊娠期暴露による，子の雄性生殖機能への影響，性ホルモン，甲状腺ホルモンなどの内分泌への影響，免疫系への影響を検討した。また，２）ＴＣＤＤの作用の機作に関する研究として，(1)ＴＣＤＤの毒性発現機序におけるｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅの関与　(2)ＴＣＤＤによる肝のＣＹＰ１Ａ１ｍＲＮＡ遺伝子発現の系統差の分子レベルでの解明　(3)ダイオキシンの毒性と分子構造・電子状態の相関に関する研究を行った。
　課題２では(1)スクリーニング手法検討の一環として，ヒト生殖器官（子宮，前立腺）由来の細胞株におけるＴＣＤＤと性ホルモンの相互作用の検討を行った。また(2)ダイオキシンの暴露とそれによる健康影響との関連を検討するために，ヒト脂肪組織，精液および卵胞液のダイオキシン濃度の測定および血中のＣＹＰ１Ａ１ｍＲＮＡ発現を調べた。

〔成　果〕
課題１　定量的リスク評価のための環境中のホルモン様化学物質の生殖・発生影響に関する実験的研究
　１）生殖機能の発生過程に及ぼす影響　
　妊娠１５日のＨｏｌｔｚｍａｎラットに１２．５，５０，２００および８００ｎｇ／ｋｇ体重のＴＣＤＤを一回経口投与した。雄について生後４９，６３，１２０日後に解剖し，性ホルモン，甲状腺ホルモン（Ｔ３，Ｔ４）などの内分泌への影響，免疫系への影響，雄性生殖機能への影響について検索した。その結果，出生仔の数，性比，体重に暴露群と対照群の間に有意の差はなかった。血清中のＴ４濃度は，生後６３日齢の８００ｎｇ／ｋｇ投与群において対照に比べ有意に低下していた。血清Ｔ３およびＴＳＨ濃度はいずれの発育ステージにおいてもＴＣＤＤによる影響は見られなかった。臓器重量については，６３日齢のＴＣＤＤ８００ｎｇ／ｋｇ投与群において対照群に比べ肝重量の増加（１５．３％），胸腺重量の減少（２０．１％）が見られた。病理組織所見では一部のラットに甲状腺肥大とろ胞細胞の過形成（１２０日齢の８００ｎｇ／ｋｇ投与群，２／１２）が認められた。免疫系への影響としては４９日齢で，脾細胞数が用量依存的に減少し，５０ｎｇ／ｋｇ以上で有意の差が認められた。１２０日齢では胸腺の細胞数に用量に依存した減少傾向が見られた。胸腺細胞のＣＤ４＋Ｃ Ｄ８Ｔ細胞の割合は１２０日齢の２００ｎｇ／ｋｇ群で有意に高かった。雄性生殖器官では，精巣重量，一日精子産生数（ＤＳＰ），精巣上体重量，精巣上体尾部精子数（ＳＲ）に変化は認められなかった。副生殖腺のうち，前立腺重量は４９日齢では８００ｎｇ／ｋｇ群で，１２０日齢では１２．５，２００および８００ｎｇ／ｋｇで有意に減少した。肛門性器間距離は，３，４９，６３，１２０日齢の各ステージで２００ｎｇ／ｋｇ以上で明らかな減少が見られた。雄性生殖器では発生過程においてテストステロンに反応して発達する精巣，精巣上体よりもデヒドロテストステロンに反応する前立腺，外生殖器（肛門性器間距離）に低用量ＴＣＤＤの影響が見られた。組織中ＴＣＤＤ濃度は，血清，肝，脂肪組織で用量に依存した蓄積が認められた。
　２）ＴＣＤＤの作用の機作に関する研究　
　(1)ＴＣＤＤの毒性発現機序におけるｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅの関与
　１００〜１０００ｎｇ ＴＣＤＤ／ｋｇ投与した雌ＳＤラットにおいてＣＹＰ１Ａ１の誘導がみられ，肝ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔにおいて約５５ｋＤａのｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅが活性化された。このｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅは，ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ，ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ， ｓｒｃ ｋｉｎａｓｅと異なることが確認された。ＴＣＤＤの毒性発現にｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅの活性化を介する系があることが示唆された。
　(2)ＴＣＤＤによる肝のＣＹＰ１Ａ１ｍＲＮＡ遺伝子発現ののラット系統差の分子レベルでの解明
　ダイオキシンの多くの作用はＡｈレセプターおよびＡＲＮＴというタンパク質との結合を介して発現すると考えられている。ＴＣＤＤによる肝のＣＹＰ１Ａ１ｍＲＮＡ遺伝子発現の高い系統ではＡｈレセプターの発現も高かった。また，ＡＲＮＴにｗｉｌｄ ｆｏｒｍのほかに４５ｂｐが欠損したｖａｒｉａｎｔ ｆｏｒｍが見いだされ，ＣＹＰ１Ａ１ ｍＲＮＡ遺伝子発現の高い系統ではｗｉｌｄ ｆｏｒｍが優勢であった。ＣＹＰ１Ａ１ｍＲＮＡ遺伝子発現の系統差にＡｈレセプターおよびＡＲＮＴが関与している可能性が示唆された。
　(3)ダイオキシンの毒性と分子構造・電子状態の相関に関する研究
　スーパーコンピュータを用いて，ＴＣＤＤをはじめとする数種のダイオキシン異性体の重要な物理化学定数であるイオン化ポテンシャル，電子親和力を計算し，実験値との良い一致を見た。また，ダイオキシンの前駆体の一つとして考えられている２−ｃｈｌｏｒｏ−２’−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｅｒからＨＣｌが脱離し，ｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎへ至る反応経路について，中間体，遷移状態を含む定量的反応経路解析を行った。
課題２　環境中のホルモン様化学物質のスクリーニング手法及び暴露量の推定に関する研究
　１）ヒト生殖器官（子宮，前立腺）由来の細胞株におけるＴＣＤＤと性ホルモンの相互作用
　子宮内膜腫由来の細胞株ＲＬ−９５−２とＫＬＥではＴＣＤＤに対する反応性が大きく異なる。反応性の低いＫＬＥではエストロジェンのシグナル伝達機構に欠陥のあることが見いだされた。ＫＬＥに正常なヒト・エストロジェンレセプター（ＥＲ−α）を組み込むとＴＣＤＤへの反応性が回復した。ＥＲ−αがＴＣＤＤへの反応性の正の修飾因子として作用していることが示唆された。ヒト前立腺腫由来の細胞株ＬＮＣａｐにおいてＴＣＤＤは抗アンドロジェン様に作用し，ＴＣＤＤとテストステロンは相互にそれぞれのリガンドに依存した転写を阻害することが示された。
　２）ダイオキシンの暴露とそれによる健康影響との関連
　大学の産婦人科の協力を得て子宮内膜症患者の卵胞液，脂肪組織，不妊外来を訪れた男性患者の精液中のダイオキシン濃度を測定した。子宮内膜症患者の脂肪組織では対照と比べて高い傾向が見られた。精液では精子数が正常（４０００万／ｍｌ以上）のグループの方がダイオキシンが高い傾向が見られた。
　焼却場からのダイオキシン暴露の可能性のある者を含む３５名のダイオキシン測定済みの血液を用いて，ＣＹＰ１Ａ１
ｍＲＮＡの発現を調べた。ダイオキシン濃度（ＴＥＱ／ｆａｔ）
（脂質当たりの毒性等価量）との間に負の相関が見いだされたが，全血中の濃度との間には関連はみられなかった。
〔発　表〕Ｂ−７５，７６， ７９， １８６， ｂ−２９６， ２９９， ３００， ｅ−１７， ５０