特別研究

２．微生物を用いた汚染土壌・地下水の浄化機構に関する研究（最終年度）

〔担当者〕

〔期　間〕
平成８〜１０年度（１９９６〜１９９８年度）

〔目　的〕
全国各地の土壌・地下水中からトリクロロエチレン（ＴＣＥ）およびトリクロロエタン（ＴＣＡ）等の揮発性有機塩素化合物並びに重金属等が検出され大きな問題となっており，浄化対策として種々の物理化学的手法が用いられている。しかしながら揚水ばっ気や真空抽出法は，コストが高い点，また根本的な分解除去法でないため，新たな浄化技術として，微生物機能を活用して汚染した環境を修復するバイオレメディエ−ション技術が注目されているが，技術開発が遅れているのが現状である。本研究は，このような状況を踏まえ，汚染土壌の浄化に有用な浄化微生物を探索し，浄化機構を解明するとともに，浄化効果の試験方法を開発することを目的とする。

〔内　容〕
全国各地の土壌より，浄化能を有する微生物を探索・分離するとともに浄化能を定量化し，ついで，汚染物質分解酵素および分解酵素遺伝子を単離し，その構造と性質を調べるとともに，分解能を強化した微生物を創生する。さらに，浄化微生物の環境利用に際し，適正管理に資するための浄化微生物の迅速・高感度検出法を開発するとともに，自然環境を模擬したフラスコ土壌系あるいは土壌シミュレ−タ系を用いて，微生物の持つ浄化機能の定量化試験方法を開発する。以上の研究を実施するため，以下の２つの課題と各４つのサブテーマを設定し研究を遂行する。
（１）土壌・地下水浄化微生物の開発と浄化機構の解明に関する研究
　１）浄化微生物の探索と浄化特性の解明
　２）浄化酵素及び浄化酵素遺伝子の単離と諸性質の解明
　３）浄化機能強化型微生物の作成
　４）浄化微生物の検出法の開発
（２）微生物浄化機能の試験方法の開発に関する研究
　１）フラスコ土壌系による浄化機能試験方法の開発
　２）土壌シミュレータによる浄化機能試験方法の開発
　３）バイオリアクターによる浄化機能試験方法の開発
　４）バイオレメディエーション技術のリスク評価手法の開発

〔成　果〕
（１）浄化微生物の探索と浄化特性の解明
　土壌から高濃度ＴＣＡ及びＴＣＥを同時に分解するエタン酸化細菌ＴＡ２７株及びＴＡ５株を分離した。ＴＡ２７株について１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った結果，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍと高い相同性を示したが，新菌株と考えられた。ＴＡ２７株はエタン，プロパン及びグルコース等各種の炭素源を資化し，各種揮発性有機塩素化合物を好気的に分解した。ＴＡ２７株はエタン濃度３％のときに１ｍｇ／ｌのＴＣＥを２日目で８５％以上分解し，エタン濃度が高い場合には，高濃度のＴＣＥ中で増殖が可能であった。ＴＣＥとＴＣＡの共存下ではＴＣＥの方が速い速度で分解された。
　クリーニング工場排水口側溝の土壌からＰＣＥを分解する混合微生物系を得た。本混合微生物系を継代培養することにより，１６０ｍｇ／ｌの高濃度ＰＣＥを分解することが可能となった。分解至適条件を検討した結果，ｐＨ７付近，３０度前後で最大分解活性を示した。
（２）浄化酵素及び浄化酵素遺伝子の単離と諸性質の解明
　ＴＣＥを分解するＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．Ｍ（Ｍ株）の分解酵素遺伝子のシークエンスを行い，分解酵素の構造を検討した。ＴＣＥの分解に関与する可溶性メタンモノオキシゲナーゼ（ｓＭＭＯ）は３つのコンポーネント（ヒドロキシラーゼ，レダクターゼ，コンポーネントＢ ）からなることを明らかにしたが，このコンポーネントを再構築しｓＭＭＯ系およびＨ２Ｏ２ ／ヒドロキシゲナーゼ系の機能の解明を行った。炭素数４以上の直鎖アルカンを基質とした場合，両系における生産物構成比に差異が認められた。枝分かれ構造のイソペンタンを基質とした場合の生産物構成比の比較から，ヒドロキシラーゼの活性部位の立体構造がレダクターゼおよびコンポーネントＢの結合により変化する可能性が示唆され，これが各種の化合物を分解できる原因と考えられた。
（３）浄化微生物の検出法の開発
　直接ＰＣＲ法によりＭ株を検出するためのプライマーを設計し，Ｍ株と土着の微生物が混在している条件での検出条件の検討を行った。その結果，近縁の６種のメタン資化性菌と区別可能な検出法を確立できた。現場地下水中ではＰＣＲ反応が阻害され，Ｍ株の検出感度が著しく低下するため，地下水試料を０．２２μｍメンブランフィルターでろ過し，可溶性のＰＣＲ阻害物質の除去を試みた結果，蒸留水と同等の感度が得ることに成功した。従来の培養によるメタン資化性菌の計数には１ヵ月を要したが，本ＰＣＲ−ＭＰＮ法を用いることにより１日で計数が可能となった。
（４）フラスコ・カラム土壌系による浄化試験方法の開発
　バイアルビンを用いてＭ株の飽和および不飽和土壌中でのＴＣＥの分解能の評価を行った。Ｍ株の添加濃度を高くするにつれ分解速度は上昇した。５０ｍｇ／ｌのＴＣＥでも分解が可能であり，汚染土壌の浄化に有用であることが判明した。
　フラスコ土壌系で，火山灰土及び砂質土でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＰｐＹ１０１（ナリジキシン酸耐性）菌の生残に及ぼす各種の要因について検討した。火山灰土の場合，ｐＨ７以上の土壌では，１日後に１００倍の１０８ぐらいまで増加し，その後４週目まで菌数はほとんど変化しなかった。低ｐＨでは菌数は急激に減少した。砂質土でも同様な傾向が認められた。土壌ｐＨは生残性に大きく関与していた。
　内径３ｃｍ，長さ４０ｃｍ，内容量２８０ｍｌのステンレスカラムに汚染土壌を充てんし，ＴＣＥ１ｍｇ／ｌに調整した現場地下水を下部より通水し，流出水のＴＣＥ濃度が一定になった後に，Ｍ株１．４×１０９，２．８×１０９，２．８×１０１０ ｃｅｌｌｓをそれぞれのカラムに接種し，メタン，酵素，窒素，リン，ＴＣＥを添加した地下水を７０ｍｌ／ｄａｙの流速で通水し，流入・流出水のＴＣＥ，メタン，メタン資化性菌数の測定を行った。ＴＣＥはＭ株を添加した系の２日目から分解が認められＭ株の添加量の増大によりＴＣＥ分解量は増大した。１６日目で２．８×１０９ ｃｅｌｌｓのとき４０％の除去率が得られ，現場への適応性が示唆された。
　同時にバイオレメディエーション技術の生態系へ影響評価を行った。Ｍ株をカラム当たり５×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように添加し，流入水及び流出水中の一般細菌数，ｐＨ，メタン濃度，ＤＯ，窒素及びリン濃度を測定した。メタン，酸素，窒素，リンにＭ株を添加した系は，Ｍ株を添加しない系と比較して著しく高いメタンの消費が認められ，流出水中のＭ株濃度は１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌのオーダーであった。Ｍ株添加による流出水中へのｐＨ，ＤＯ，一般細菌への影響は認められなかった。
（５）土壌シミュレーターによる浄化機能試験方法の開発
　土壌シミュレーターを用いて，土壌中におけるＭ株の挙動および生態系への影響を検討した。屋内ライシメーター（６０Ｗ×４５Ｄ×５０Ｈｃｍ），屋外ライシメーター（８０Ｗ×５７Ｄ×５０Ｈｃｍ）に黒ボク土壌を充てんし，表層から１０ｃｍまでの土壌が約１０８ ｃｅｌｌｓ／ｇ乾土になるようＭ株を添加した。０〜１０，１０〜３０ｃｍの深さの土壌試料を採取し，Ｍ株を計数するとともにＭ株の影響を調べた。Ｍ株は比較的土壌中での生残性が高いこと，表層１０ｃｍの土壌における，一般細菌，グラム陰性菌，糸状菌，呼吸活性および各種土壌酵素活性，さらに水分含量，ｐＨ，全炭素，全窒素含量にはＭ株はほとんど影響を及ぼさなかった。
（６）バイオリアクターによる水銀除去
　大腸菌のプラスミドＮＲ１由来の水銀還元酵素遺伝子群（ｍｅｒオペロン）を組み込んだ組換え微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＰｐＹ１０１／ｐＳＲ１３４を用いて，緩衝液中の水銀除去実験を行った。水銀除去の最適条件は，５ｍＭのチオグリコール酸ナトリウム，３０度，ｐＨ ７．０，菌体濃度０．５ｇ／ｌであり，４０ｐｐｍの塩化第二水銀が２４時間で完全に除去された。除去された水銀はほぼ完全に回収された。水銀を添加した河川水，海水から本システムを用いて水銀除去を試みたところ，いずれも約９０％の除去が認められ，微生物による水銀の除去が可能であることが判明した。
（７）バイオレメディエーションのリスク評価
　土壌浄化のためのバイオレメディエーション技術のリスク評価項目として，微生物の人への毒性，魚，ミジンコ，藻類への影響，さらに土壌生態系としての細菌，放線菌，糸状菌，土壌呼吸活性，酵素活性への影響を調べるとともに，添加微生物の生残性，微生物によるの有害代謝生成物，添加物質の挙動等を調べることが重要であることを提案した。
〔発　表〕Ｂ−１６７，１６９， Ｇ−１４， １５， １７， ｂ−１１０〜１１８， ２６６〜２７７， ｇ−４０